UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DPTO. BIOLOGÍA VEGETAL 1 (CÁTEDRA DE FISIOLOGíA VEGETAL)

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1 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DPTO. BIOLOGÍA VEGETAL 1 (CÁTEDRA DE FISIOLOGíA VEGETAL) ESTUDIO DE LA ACCIÓN DESFOLIANTE DE EPÍFITOS SOBRE ESPECIES DE QUERCUS UNIVERSIDAD COMPLUTENSE t-n- TESIS DOCTORAL KHALID BOUAID Madrid,

2 2$.o;t1 Khal d Boaid ESTUDIO DE LA ACCIÓN DESFOLIANTE DE EPÍFITOS SOBRE ESPECIES DE QUERCUS Director: Prof. Dr. D. Carlos Vicente Córdoba Catedrático de Fisiología Vegetal de la Facltad de Ciencias Biológicas Universidad Compltense de Madrid Facltad de Ciencias Biológicas Dpto. Biología Vegetal 1 (Cátedra de Fisiología Vegetal) Madrid, ~IBLiOTEGA

3 Trabajo realizado en la Cátedra de Fisiología Vegetal del Departamento de Biología Vegetal 1, de la Facltad de Ciencias Biológicas, de la Universidad Compltense, qe se presenta para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas. Madrid, Febrero de 1999 Fdo.: Khalid Boaid Conforme, el Director de la Tesis Fdo.: Prof. Dr. D. Carlos Vicente Córdoba.

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6 En la cima de las montañas, en el seno de las nbes, dentro de la lna o bajo los cielos me acordará de todo lo qe han hecho por mí, llegará donde llege, nnca me olvidará de ellos, estaran siempre presentes en mi corazón y si no fera por ellos no hbiera llegado a ser nada. A mi madre Fátima Serrokh y a mi padre Ahmed Boaid, por el espírit intelectal qe me han transplantado desde peqeño. A mi hermano Mohamed por ss aydas economí cas y otras, a mis hermanos Rachid, Abderrahim y Monir por todo lo qe han hecho por mx. A mis profesores. A mis amigos. A todos los investigadores.

7 AGRADECIMIENTOS Antes de todo qiero dar las gracias a Dios por darme el poder sficientepara sperar todos los obstáclos y poder hacer esta Tesis a pesar de las condiciones económicas y de otro tipo. Esta Tesis Doctoral es el frto de n árbol qe se plantó hace nos años y ha ido creciendo hasta alcanzar s madrez, la cal se refleja en ss páginas coloreadas. Sin embargo, para qe n árbol tenga este aspecto ha debido poseer nas raíces my profndas, qe le permitieran obtener diferentes alimentos para nirlos en na tarea común absoltamente silenciosa y frctífera. Presento así el trabajo y el esferzo de todas las personas qe, como los ntrientes en cestión, me han aydado a elaborar esta Tesis ya qe sin ss aportaciones el árbol no hbiera sperado ss primeros días. A esas personas me gstaría dedicarles nas palabras qe expresaran mi profndo agradecimiento. En primer lgar, debo referirme al ntriente qe ha sido la clave del desarrollo de este árbol. Esta persona me ofreció na llave qe me facilitó el acceso a n mndo lleno de conocimiento, sabidría y criosidad. Con esa llave pde abrir mchas pedas conociendo cada vez cosas nevas y gente neva qe me aportaron y me sigen aportando ideas. Esta persona es mi director el Prof Dr. D. Carlos Vicente Córdoba. Gracias, jefe, no sólo por la llave simbólica sino también por la libertad qe siempre me has dado para planificar y orientar de n modo otro todos los trabajos de la Tesis. Mi sincero agradecimiento a la Prof Dra. Dfia. María Estrella Legaz (Maestra de HPLC) por s inestimable ayda como profesora y amiga, y por las extensas conversaciones qe hemos tenido a lo largo de estos años las cales me han aportado mchísimas cosas; la más importante, el ejemplo de tolerancia entre personas con la misma formación científica pero de cltras y costmbres diferentes qe deben formar na parte inseparable de nestra vida. Mchas gracias también por s

8 vigilancia pennanente para no faltar a las oraciones del viernes. Gracias por todo y más por los conocimientos y las técnicas qe aprendí gracias a ti. Qiero agradecer a la Dra. Dña. Carmen Ascaso y a s eqipo científico del centro de Ciencias Medioambientales del Consejo Sperior de Investigaciones Científicas (C.S.I.C) primero s amabilidad y lego la atención qe me han prestado en mchísimas ocasiones, especialmente s colaboración en los estdios ltraestrctrales realizados gracias a las técnicas de microscopia electrónica de dicho centro. Mi agradecimiento llega también a Fernando, María José y Asnción, sin olvidarme de mi amiga y profesora la Dra. Dfia. Rosario De Felipe y s ben comportamiento conmigo. En el Institto de Qímica Orgánica del C.S.I.C, el Dr. D. Jesús Sanz Percha, realizó el espectro de masas de na estrctra qímica hasta ahora desconocida. Hacía él, mi gratitd. Qiero agradecer al Dr. D. Adolfo Avalos s ejemplar amistad y s colaboración en bena parte de los trabajos de esta Tesis, sobre todo, en lo qe se refiere a los experimentos de campo. Sin irme my lejos, qiero agradecer a s esposa, la Dra. Dita. Elena Peréz-Urría al recordarme qe es hora de tomar café, cando la veo con dos o mas tazas en la mano. Aprovecho para recordarle qe me debe n regalo mágico. Mi agradecimiento llega a la Prof Dra. Dita. Pilar Estevéz por s incondicional ayda en el préstamo de bibliografia. También aprovecho la ocasión para agradecer a la Prof Dra. Dita. Blanca Cifentes s ayda, así como los libros y separatas qe me facilitó. Hago extensible mi agradecimiento al resto de los Profesores de esta Cátedra, -Dres. Martín Calvarro, Rodrigez, Ramírez, Llamas, Maeso y Martín y al personal no docente, entre los qe no debo olvidar a Raqel, Cesar y a na persona my respetable y amable qe no aparece mcho por aqí pero qe le tenemos siempre en

9 nestros corazones por s amabilidad y s manera de ser, es Bernabé. Me bajo na planta para encontrarme con mi lámpara de Aladino en la resolción de los problemas informáticos, es el Dr. D. José María Hernández; a él le agradezco mchísimo el haberme reselto la mayoría de mis ddas. Aprovechando mi visita a la carta planta, hago extensivo mi agradecimiento a todos los Profesores, doctorandos y personal no docente de la Unidad de Botánica. Mi agradecimiento llega también a mis profesores y amigos de Marrecos con los cales aprendí a valorar el papel de la ciencia en el ben desarrollo de nestra personalidad y nestra sociedad, así qiero recordar especialmente a mi amigo y profesor Dr. D. Lamarti Ahmed y espero qe pronto llegemos a poner en marcha n proyecto de cooperación entre la UCM y la Universidad Abdelmalek Essaadi de Tetoan. Mi agradecimiento llega también a los profesores de dicha Universidad y sobre todo los Dres. Idda Omar y Amezian Hassan. Qiero recordar a mis amigos cbanos, con los cales compartí mchos momentos en el laboratorio, especialmente a la Dra. Pitón, al Dr. de Armas, y a los compañeros, Maritza, Carlos W, Mario, Manel y Paz. Llega el momento de recordar a mis compañeros más directos drante estos años. A la Dra. Dita. María del Carmen Molina Cobos, le agradezco el haberme aydado en tantas ocasiones y el indicarme algnos caminos; también por ser el ATP del laboratorio. Al Dr. D. José Lis Mateos, por s ejemplar amistad, y por ss inolvidables chistes y bromas. A la Dra. Dita. Mercedes Martín por s bena compañía, sobre todo cando compartimos los dos el laboratorio 3 al llegar a España. Al Sr. Abdelón, corazón de melón por ser el único bereber rebelde qe conocí en mi vida; qiero recordarle qe somos mslmanes antes de ser árabes o bereberes. Beno señorito, a ver si empiezas a escribir ya la Tesis, qe tengas serte. A Teresa qe espero le vayan bien las cosas y nos deje algna probeta libre. A Najat, por dar n ben ejemplo sobre las verdaderas mjeres mslmanas, estdiosas y trabajadoras, espero qe pronto llege a n acerdo con ss poliaminas. A Blanca, por todo lo qe hizo por mí, le deseo todo tipo de éxito. A Tatiana, qe parece qe se

10 ha olvidado de nosotros y ha hecho otros amigos nevos pero nosotros no nos vamos a olvidar de s sonrisa típica. A Libertad por tener toda la libertad de ser natral y disfrtar de los desaynos y meriendas con frta pra, te deseo mcha serte y a ver si empieces ya por na vez la Tesina. A mis amigos Chloé y Patrick les deseo mcha serte en esta vida y qe no se olviden de los benos ratos qe hemos pasado jntos. A mis amigos Javier, Lordes, Beatriz y Vanesa, por pregntarme siempre cómo me van las cosas. A mi amigo argelino Abdessalam, por ss virtdes y por tener los estdios como s única preocpación. A mis amigos de la Asociación de Estdiantes Marroqíes. No qiero olvidarme de Mohamed, Yazid, Himi, Morad, Jaoad, Saif, Abdessalam, Said, Ikken, Nadial, Nadiall, Khalid, Abanor, Dahbi y otros. A mis amigos Badreddine, Adil, Jalal, Dahbi, Akhdar, Ibrahim, Moali, Hamdon, Hamid, Bohassani, Omar, Ah, Zoni, Sabbar, Said, Serrokh, Jemraoí, Bahhat, Fassí y Rachid. A mis amigos del programa Alien de la tele de Catro Caminos, Artro, Beatriz y el eqipo entero, a mis amigos de la academia, Elsa y Paloma. A todos les agradezco lo qe han hecho por mí. A Nardy, a qien la deseo mcha serte en esta vida y también a s familia, sin olvidarme de la Chlina. Te agradezco mcho t pntalidad y te digo: No seas tanflojatía Qiero recordar a todos mis amigos de Perú, sobre todo, Cristian, Maritza, María y Olga; a mis amigos de Bolivia, Papá, Javier, Leli, la flaca y s hermano; también a mis amigos y amigas de Ecador, sobre todo los qe participan con nosotros en el programa de Tele. En fin, qiero agradecer a toda persona relacionada directa o indirectamente con esta Tesis, calqier cosa qe me enseñaron en este país.

11 Abreviatra xi ADN: Sc/do desoxirribonclélco. AlA: áddo-3-indolacético. ATP: adenosina-5-trlfosfato. CP 1: complejo dorofila-proteína 1 qe indye el P700. CP4: comp/e/o clorofila-proteína IV qe probablemente inclye elpóbo. DCMU: N -(3, 4-diclorofenil)-N,N-dimetli rea. DCPIP: 2,6-dilorofenol indofenol EF: cara de fractra ectoplásmlca. ES: sperfide ectoplásmlca natral HPLC: cromatogralia líqida de alta resoldón (High Performance Liqid Chromatography). IR: nfrarro/o LHCI: complejo colector ligado a PSI. LHCP: comple/o colector < Light-Harvesting-chlorophylla/b Protein complexes) MEB: microscopia elearón/ca de barrida MET: microscopia electrónica de transmisión. MS: espectrometría de masas. NADPH: fosfato de nicotinamida-adenin-dlndeátido fosfato redddo. PáBO: pfgniento fotoactivo del fotosistema II. P700: p4mento fotoactivo delfotoslstema 1 PAGE: Electroforesis en gel de pollacrilamida (PolyAc ylamlde Gel Electroforésls,>. PF: cara de fractra protoplásmica. PS: sperfide protoplásmica natral PSI: fotoslstema 1. PSII: fotosistema II. QE: plastoqinona B. TLC: cromatogralia en capa fina (TUn 1ayer C hromatography,>.

12 Indice xii 1. INTRODUCCION LOS LÍQIJENES Consideraciones generales Repartición y número de especies Historia del liqen Definición de n liqen Líqenes epífitos Ecología y ecofisiología de la implantación del epifito Sstancias liqenícas Denominación y natraleza de sstancias liqénicas Localización y concentración Biogénesis de las sstancias liqénicas Importancia de las sstancias liqénicas Relación del liqen con el fitóforo Del epifitismo al parasitismo Penetración del epifito en s sstrato Interacciones ntricionales entre líqenes epífitos y s fitóforo Liqen epifito: Everniaprnastri (L.) Ach Características diferenciales Sstancias liqénicas características Relación con el fitóforo FISIOLOGIA Y ULTRAESTRUCTURA DE LA DESFOLIACION MECANISMO DE LA FOTOSÑTESIS EN PLANTAS SUPERIORES El cloroplasto fncional Constitción de fotosistemas para fotosíntesis oxigénica Topografia funcional de las lamelas tilacoidales Clorofilas de plantas speriores REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL Consideraciones generales y desarrollo histórico Axina Descbrimiento y localizacion Relación entre estrctra y actividad Biosíntesis en plantas speriores Los conjgados de la axina Descbrimiento de los conjgados de axina Hidrólisis de los conjgados de la axina Oxidación de la axina Oxidación descarboxilativa Oxidación no descarboxilativa 42

13 Indice xiii 2. OBJETIVOS MI4TERIALYMETODOS SELECCIÓN DE ORGANISMOS OBTENCIÓN DE SUSTANCIAS LIQUÉMCAS DE EVERNIA PRUNASTRI(L.) ACH Análisis del extracto acetónico Cromatografia en capa fina Cromatografia líqida de alta resolción Espectrometría de masas VISUALIZACIÓN DE SUSTANCIAS LIQUÉNICAS DE EVERNIA PRUNASTRI POR MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE BARRIDO CARACTERIZACIÓN FITOQUÓMICA DE HOJAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLIA LAM Test para fenoles y taninos Test para antocianinas, antocianidinas y flavonoides Testparaalcaloides Test para esteroides, triterpenoides y saponinas VARIACIÓN DE LOS FENOLES EN LA SAVIA XILEMTICA DEL FITÓFORO Técnicas de cromatografia en capa fina Técnicas de cromatografia líqida de alta resolción CONDICIONES DE INCUBACION DE LAS RAMAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLIA LAM MEDIDA DE LA REACCIÓN DE HILL Obtención de cloroplastos Ensayos de la actividad fotolítica Medida de clorofilas ESTUDIO DE LA DEGRADACIÓN DE CLOROFILAS CAUSADA POR LAS SUSTANCIAS LIQUENICAS Valoración de la degradación de clorofilas por espectrofotometría Valoración de la degradación de clorofilas por HPLC Técnicas de cromatografia de alta resolción 56

14 Indice xiv Estdio de la penetración de fenoles en el interior del cloroplasto Estdio de la degradación de clorofilas y cantificación de prodctos OBSERVACIÓN ULTRAESTRUCTURAL DE LAS HOJAS DE RAMAS SIN Y CON UNA DENSA COBERTURA LIQUÉNICA Técnicas de microscopia electrónica para el estdio del efecto de las sstancias liqénicas sobre los cloroplastos Cortes ltrafinos Fijación Deshidratacion Inclsión Ultramicrotomía Tinción Toma de fotografias Análisis de imagen CONDICIONES DE TRATAMIENTO DE LAS YEMAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLL4 LAM. POR AUXINA EXÓGENA ANÁLISIS Y VALORACIÓN DE AUXINA EN YEMAS CON Y SIN TRATAMIENTO POR AUXINAS EXÓGENAS Extracción de axina Técnicas de TLC Prificación de la axína Técnicas de espectrofotometría Técnicas de HPLC ANÁLISIS DEL CONJUGADO AUXINA-SUSTANCIA LIQUÉNICA PORHPLC ANÁLISIS DE LA INCUBACIÓN DE LA AUXINA CON PEROXIDASA CON Y SIN PRESENCIA DE ÁCIDO ÚSNICO POR IIPLC OBTENCIÓN DE SUSTANCIAS LIQUÉNICAS DE PSIRMELL4 HYPOLEUCINA (J.) STEIN Análisis del extracto acetónico Técnicas de cromatografia en capafina Técnicas de cromatografia bidimensional Técnicas de cromatografia de alta resolción 65

15 Indice xv 4. RESULTADOS IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS SUSTANCIAS LIQUÉNICAS DE EVERNIA FRUNASTRI Cromatografia en capa fina Cromatografia líqida de alta resolción Microscopia electrónica de barrido Espectrometría de masas CARACTERIZACIÓN FITOQUIMICA DE HOJAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLIA LAM VARIACIÓN ANUAL DE FENOLES ENEL XILEMA DE RAMAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLL4 LAM APLICACIÓN DE SUSTANCIAS LIQUÉNICAS EXÓGENAS A CORTES DE RAMAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLL4 LAM PENETRACIÓN DE SUSTANCIAS LIQUÉN?ICAS EN CLOROPLASTOS AISLADOS DE HOJAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLL4 LAM MEDIDA DE LA REACCIÓN DE HILL EN HOJAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLL4 LAM DEGRADACIÓN DE CLOROFILAS Y CUANTIFICACIÓN DE PRODUCTOS POR CROMATOGRAFIA LiQUIDA DE ALTA RESOLUCION ESTUDIO MORFOMÉTRICO COMPARATIVO DE LAS HOJAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLIA LAM Alteración de la estrctra del cloroplasto por sstancias liqénicas Alteración de la organización de tilacoides por sstancias liqenícas APLICACIÓN DE AUXINAS EXÓGENAS A LAS YEMAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLL4 LAM. CON COBERTURA LIQUÉNICA ANÁLISIS Y CUANTIFICACIÓN DE AUXINAS EN YEMAS CON Y SIN TRATAMIENTO CON AUXINAS EXÓGENAS Detección de axina por cromatografia en capa fina Espectrofotometría Cromatografla líqida de alta resolción 116

16 Indice xvi VARIACIÓN MENSUAL DE AUXINAS EN YEMAS Y RAMAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLLI LAM. CON Y SIN UNA COBERTURA LIQUÉNICA CONJUGACIÓN DE AUXINA Y ÁCIDO ÚSNICO TRAS SU INCUBACIÓN IN VITRO INHIBICIÓN DE LA DEGRADACIÓN DE LA AUXINA POR PEROXIDASA EN PRESENCIA DEL ÁCIDO ÚSNICO IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS SUSTANCIAS LIQUÉNICAS DE PARMELIA HYPOLEUCINA (J.) STEIN DISCUSION CONCLUSIONES BIBLIOGRAFíA 165

17 Indice deflgras xvii Fig. 1: Biogénesis de sstancias liqénicas 14 Fig. 2: Sstancias liqénicas de Everniaprnastri (L.) Ach 21 Fig. 3: Rtas de síntesis del ácido indol-3-acético a partir del triptófano 37 Fig. 4: Qercs rotndwolia Lam. sin (A) y con na densa (B) población liqénica, principalmente de Everniaprnastri (L.) Ach 67 Fig. 5: Proporción de las sstancias liqénicas en el talo de Evernia prnastri (L.) Ach 73 Fig. 6: Evernia prnastri (L.) Ach. Detalle de las sstancias liqénicas de la médla próximas al córtex sperior 74 Fig. 7: Everniaprnastri (L.) Ach. Detalle del córtex sperior 75 Fig. 8: Evernia prnastri (L.) Ach. Detalle de las sstancias liqénicas de la médla cercana al córtex inferior 76 Fig. 9: Everniaprnastri (L.) Ach. Detalle de la médla 77 Fig. 10: Espectro de masas de la sstancia de RJ 0,19 en silicagel Fig. 11: Estrctra qímica propesta para el dímero del ácido evérnico y estrctra qímica del ácido disolorínico 79 Fig. 12: Estrctras qímicas propestas como interpretación de las seitales m/z de los diferentes fragmentos del dímero del ácido evémico obtenidos por espectrometría de masas 80 Fig. 13: Qercs rotndifolia. Análisis por TLC del xilema de ramas con na densa población del liqen epifito Everniaprnastrr 86 Fig. 14: Variación mensal del ácido evérnico en ramas de Qercs rotnd~olia con líqenes epífitos 87 Fig. 15: Variación mensal del ácido úsnico en ramas de Qercs rotndifolia con líqenes epífitos 88 Fig. 16: Permeabilidad de la membrana cloroplástica de hojas de Qercs rotndwolia a las sstancias liqénicas de Evernia prnastri 92

18 Indice defigras XVU Fig. 17: Máximos de absorbancia de clorofila de hojas de Qercs rotndifolia Lam 93 Fíg. 18: Medida de la concentración de clorofilas a y b procedentes de hojas pertenecientes a ramas de Qercs rotndifolia Lam 94 Fig. 19: Liberación de oxígeno, por la reacción de Hill, de cloroplastos aislados de hojas de Qercs rotndwolia Lam 95 Fig. 20: Reacción de Hill en cloroplastos de hojas procedentes de ramas de Qercs rotncftfolia Lam 96 Fig. 21: Degradación de clorofilas a y Li casada por el ácido úsnico y HCI 101 Fig. 22: Degradación de clorofila a casada por las sstancias liqénicas de Everniaprnastri (L.) Ach 102 Fig. 23: Degradación de clorofila Li casada por las sstancias liqénicas de Everniaprnastri (L.) AoL 103 Fig. 24: Valoración de la degradación de clorofilas procedentes de hojas de Qercs rotndwolia Lam. casada por ácido úsnico 104 Fig. 25: Valoración de la degradación de clorofilas procedentes de hojas de Qercs rotndwolia Lam. casada por ácido evérnico 105 Fig. 26: Valoración de la degradación de clorofilas procedentes de hojas de Qercs rotndifolia Lam. casada por atranonna 106 Fig. 27: Valoración Qercs rotndifolia de la degradación Lam. casada de clorofilas por HCl procedentes de hojas de 107 Fig. 28: Valoración de la degradación de clorofilas procedentes de hojas de Qercs rotndifolia Lam. casada pornaoh 108 Fig. 29: Control de clorofilas y feofitinas a y Li sin tratamiento con sstancias liqénicas de Everniaprnastri (L.) Ach 109 Fig. 30: Control y pigmentos fotosintéticos incbados con ácido úsnico 110 Fig. 31: Qercs rotndifolia Lam. Una célla de na hoja perteneciente a rama con densa población liqénica (sección ltrafina) 111 Fig. 32: Qercs rotndwolia Lam. Una célla de na hoja perteneciente a rama libre de poblaciones liqénicas (sección ltrafina) 112

19 Indice defigras F g. 33: Qercs rotndífolia Lam. Un cloroplasto de na hoja perteneciente a na rama libre de población liqénica 113 Fig. 34: Qercs rotndvolia Lam. Un cloroplasto de na hoja perteneciente a na rama con densa población liqénica 114 Fig. 35: Qercs rotndifolia Lam. Yemas pertenecientes a ramas con na densa población liqénica, tratadas por axina exógena 10 4M dispersada en vaselina 120 Fig. 36: Qercs rotndwolia Lam. Una rama, perteneciente a n árbol con densa población liqénica, tratada por axina exógena 1 04M 121 Fig. 37: Qercs rotndifolia Lam. Una rama, perteneciente al mismo árbol de la figra 36, sin tratamiento 122 Fig. 38: Qercs rotndifolia Lam. Una rama, perteneciente a n árbol con densa población liqénica, tratada por axina exógena 1 05M 123 Fig. 39: Qercs rotndffolia Lam. Una rama, perteneciente al mismo árbol de la figra 38, sin tratamiento 124 Fig. 40: Qercs rotndifolia Lam. Una rama, perteneciente a n árbol con densa población liqénica, tratada por axina exógena 106M 125 Fig. 41: Qercs rotndifolia Lam. Una rama, perteneciente al mismo árbol de la figra 40, sin tratamiento 126 Fig. 42: Análisis espectrofotométrico de las axínas 127 Fig. 43: Axina libre y conjgada en yemas procedentes de ramas de Qercs rotnd~folia Lam 128 Fig. 44: Axina libre y conjgada en ramas de Qercs rotnd~folia Lam 129 Fig. 45: Variación mensal de axina libre en yemas procedentes de ramas de Qercs rotndwolia Lam 130 Fig. 46: Variación mensal de axina conjgada en yemas procedentes de ramas de Qercs rotndifolia Lam F g. 47~ Variación mens~ de axina libre en ramitas procedentes de ramas de Qercs rotnd<folia Lam 132 Fig. 48: Variación mensal de axina conjgada en ramitas procedentes de ramas de Qercs rotndifolia Lam 133

20 Indice de figras xx Fig. 49: Análisis por HPLC de la axina patrón y la axina extraída de yemas apicales de ramas de Qercs rotncfifolia Lam 134 Fig. 50: Análisis por HPLC del ácido úsnico patrón y ácido úsnico extraído de yemas apicales de ramas de Qercs rotnd~olia Lam 135 Fig. 51: Análisis por HPLC de la mezcla de incbación conteniendo axina patrón y ácido úsnico patrón 136 Fig. 52: Valoración por HPLC del conjgado resltante de la incbación de la axina con el ácido úsnico 137 Fig. 53: Análisis por HPLC de la incbación de axina con peroxidasa en asencia como en presencia del ácido úsnico 140 Fig. 54: Inhibición de la degradación de axina por peroxidasa en presencia del ácido úsnico 141 Fig. 55: Análisis por cromatografia bidimensional de las sstancias liqénicas de Parmelia hypolecina (J.) Stein 142 Fig. 56: Separación por cromatografia líqida de alta resolción de sstancias liqénicas de Parmelia hypolecina (J.) Stein 143 Fig. 57: Proporción de las sstancias liqénicas en el talo de Parmelia hypolecina (J.) Stein 144 Fig. 58: Estrctras qímicas de las sstancias liqénicas de Parmelia hypolecina (J.) Stein 145 Fig. 59: Fórmlas estrctrales del ácido úsnico y del ácido evérnico 150

21 Indice de tablas xxi Tabla 1: Natraleza de la simbiosis liqénica 8 Tabla 2: Valores de Rjde las sstancias liqénicas de Everniaprnastri 69 Tabla 3: Reactivos sados para la detección de las sstancias liqénicas de Everniaprnastri por TLC 70 Tabla 4: Tiempo de retención de cada na de las sstancias liqénicas de Everniaprnastri tras s separación por HPLC 69 Tabla 5: Compestos qímicos del extracto hidrofilico de hojas de Qercs rotnd,ifolia 85 Tabla 6: Detección del ácido úsnico en yemas procedentes de ramas de Qercs rotndffolia 90 Tabla 7: Concentración del ácido úsnico despés de incbarlo 5 días con ramas de Qercs rotndwolia 90 Tabla 8: Tiempo de retención de los pigmentos fotosintéticos 100 Tabla 9: Medida de número de hojas y longitd de ramas de Qercs rotndwolia con cobertra liqénica de Evernia prnastri con y sin tratamiento por axinas exógenas 10 M 118 Tabla 10: Medida de número de hojas y longitd de ramas de Qercs rotnd~olia sin tratamiento conpor cobertra axinas liqénica exógenas de 10~ Evernia 5M prnastri con y 119 Tabla 11: Medida de número de hojas y longitd de ramas de Qercs rotnd~olia con cobertra liqénica de Everniaprnastrí con y sin tratamiento por axinas exógenas 106M 119 Tabla 12:Valores de Rf obtenidas por análisis por TLC de sstancias liqénicas de Parmelia hypolecina 139 Tabla 13: Tiempo de retención de cada na de las sstancias liqénicas de Parmelia hypolecina tras s separación por HPLC 139

22 a VP. ~ IN1ROOUCCIÓN [ÁJ

23 Introdcción LOS LiQUENES Consideraciones generales Anqe los líqenes no forman na clase atónoma de criptógamas, sino qe son definidos como hongos qe viven en simbiosis con algas, se sigen estdiando como n grpo aparte, lo qe está jstificado por las particlaridades de s morfología, de s anatomía y sobre todo de s biología. Todo es especial en este grpo y la natraleza compleja de estos individos genera problemas de alto interés. Pero sólo desde la segnda mitad del pasado siglo se reconoce la verdadera natraleza de líqenes. Antes de esta época, estaban confúndidos con los otros talófitos, inclso con los briófitos, o estaban considerados como seres sencillos intermedios entre hongos y algas, formando na clase aparte de talófitos Repartición y número de especies. Más de especies de líqenes crecen en el mndo entero. Es my interesante comparar las relaciones entre el número de líqenes y el número de plantas speriores (como las coníferas y las plantas con flor) dependiendo de s localización geográfica. Esas relaciones son de 0,08 en regiones tropicales y ecatoriales (líqenes bastante nmerosos pero en número casi nlo en relación con la infinita variedad de la vegetación fanerogémica); 0,2 en región templada; 1 en región sbártica (ejemplo de la Escandinavia); de 3 hasta 5 en región ártica. La relación extrema se alcanza en el continente antártico con 80 veces más líqenes qe plantas speriores (AHMADJIAN, 1982 ayb) Historia de los líqenes La gran importancia de los líqenes y el interés por saber sobre la diversidad qe presenta este grpo, nos llevó a considerar s estdio con na cierta perspectiva,

24 Introdcción 3 primero desde la obra de DES ABBAYES (1951) en s Traité de lichenologie, y despés desde la de VAN HALUWYN y LEROND (1993) en Gide des lichens, por los nevos descbrimientos a propósito de estos seres qe normalmente no son tan sencillos como parecen y porqe de s complejidad deriva el gran papel qe peden jgar en casi todos los terrenos. Por eso hemos visto qe es my útil hacer n esqema de la historia de liqenología, haciendo referencia a la obra de DES ABBAYES, y complementarla con los nevos descbrimientos, así qe vamos a dividir tal historia en 5 etapas. ja etapa: Orizen y si2nificado antigo del liqen El ténnino liqen es my antigo; fe aplicado por primera vez a las plantas, en el siglo IV antes J.C., por el griego THEOPHRASTO, discíplo de ARISTÓTELES. Sin embargo, los líqenes de THEOPHRASTO no eran realmente nestros líqenes actales sino hepáticas, salvo dos qe podemos identificar actalmente como Usnea y Rocella. Los atores del renacimiento, en el siglo XVI, identificaron casi todos los líqenes como msgos y no diferenciaron Mscs y Liqen. La distinción entre líqenes y msgos empezó con TOURNEFORT en 1694 y 1700; sin embargo, s distinción qedó imperfecta porqe encontramos, descritos como líqenes, na Marchantia (hepática), n msgo y n helecho. En 1729 el italiano MICHELI describió mchos líqenes. Observó los apotecios y los consideró como receptáclos florales; sigió más el desarrollo de líqenes a partir de ss masas plverlentas, o soredios, qe se encentran sobre el talo de mchas especies y asimiló s prodcción a los granos. El alemán DILLENIUS (1741) tvo como base de clasificación en s obra Historia Mscorm la morfología de talos, al separar tres géneros de líqenes, Usnea, Coralloides y Liqenoides, bajo los cales están descritos verdaderos líqenes. Se nota qe hasta el momento las plantas estaban únicamente designadas bajo n nombre genérico. La nomenclatra binomial fe impesta por el seco LINNAEUS qien, en 1753, empezó a distribir los líqenes en siete secciones según la forma del talo. Pero él así como ss scesores inmediatos, no consideraron los líqenes como

25 : 4 Introdcción plantas aparte y los clasificaron con las algas. 2 etapa: Distinción entre líqenes y otros criptógamas ACHARIUS, desde 1798 hasta 1814, consigió no sólo distingir los líqenes de otras criptógamas sino qe hizo de la liqenología na rama especial dentro la Criptogamia. También reconoció los apotecios y los soredios como órganos de reprodcción de los líqenes. Por eso merece llamarse el padre de la liqenología. S clasificación se basó no solamente en la morfología del talo sino también en la de los apotecios, na clasificación de líqenes con nmerosos géneros y especies cyos nombres persistieron hasta nestros días. Es el inventor de toda na serie de términos qe sirven en la descripción de líqenes: thalls, podetim, apothecim, soredim, etc. A partir de ACHARIUS, la atención de los natralistas se centró más sobre los líqenes y los trabajos sobre ellos fueron cada vez más nmerosos. Pero la lpa era todavía el único medio de investigación. El alemán WALLROTH (1829) fe qien inventó la palabra gonidios, llamando así los elementos verdes del talo y distingiéndolos de los elementos incoloros o hifas. Pero se eqivocó sobre el significado de gonidios, ya qe los asimiló a céllas reprodctivas, anqe el nombre qe les dio, a pesar del error del qe srge, se sige sando en la actalidad. 3 etapa: El so de microscopio en ligenolozía El so de microscopio deja atrás el estdio de líqenes por la simple lpa y permitiráprecisar y conocer la verdadera natraleza de los líqenes. En 1846, el italiano DE NOTARIS mostró la importancia de las esporas para la clasificación de líqenes y el establecimiento de géneros. Este ator fe segido inmediatamente, en este camino, por el italiano MASSALONGO (1852), el alemán KOERBER (1855) y el finlandés NYLANDER (1854).

26 5 Introdcción NYLANDER (1866,1867), afincado en Francia hasta s merte (1899) consagró s existencia entera al estdio de los líqenes. S nombre domina toda la liqenología sistemática de la segnda mitad del siglo XIX por la importancia y el considerable número de especies nevas (casi especies) qe recibió de todas las partes del mndo y las describió. Fe él qien descbrió las reacciones qímicas de los compestos característicos de los líqenes y qien las aplicó al reconocimiento de especies. En 1852, el francés TULASNE pblicó na importante memoria sobre la anatomía de líqenes y sobre ss órganos reprodctores. En 1866, el alemán DE BARY emitió tímidamente la hipótesis de qe determinados líqenes eran solamente nas algas penetradas por filamentos de hongos. En 1817, CASSJNI consideró los Nostoc (cianobacterias) como nas Collema (líqenes) estériles. En 1867, FAMINTZIN y BARANETZKY y n año más tarde ITZIGSOHN llegaron a probar n cltivo en aga de nos gonidios de líqenes. 4 etapa: Descbrimiento de la verdadera natraleza del ligen SCHWENDENER, nombre clave en la liqenología, en dos célebres memorias (1867 y, sobre todo, 1869), desarrolló la hipótesis de DE BARY y se apoyó sobre hechos precisos. Reconoció, inclso, en los gonidios de líqenes, nos tipos qe se relacionan con diversas algas libres. Ennció s teoría como: los líqenes son nos seres dobles, formados por la nión de na alga y de n hongo. Al principio, esta teoría encontró na resistencia enorme por parte de los liqenólogos, tales como KOERBER (1855) y KREMPELHUBER (1872), pero el más ferte de ss detractores fe NYLANDER (1870). Otros, al contrario, feron atraídos ensegida por la neva doctrina y aportaron con ss propios trabajos na importante contribción a los argmentos de SCHWENDENER. Tal fe el francés BORNET (1873). Pero fe el francés GASTON BONNIER qien, en 1886 y 1889, aportó la más alta confirmación a la teoría algo-

27 6 Introdcción liqénica, realizando, a partir de na espora y de na alga, la síntesis de n liqen. FINK (1911) dio n paso adelante en la descripción de la natraleza doble de los líqenes considerando qe n liqen es n hongo qe vive toda o na parte de s vida parasitando na alga hésped y manteniendo na relación con s sstrato orgánico o inorgánico Desde entonces, la natraleza doble de líqenes es demostrada, y en nestros días, admitida por todos. Un compatriota de NYLANDER, ELFVING (1913) se encargó de demostrar qe la hifa sale de los gonidios. A finales del pasado siglo y a principios de éste, los trabajos de liqenología son cada vez más nmerosos. STAHL (1877), F.M. BACHMANN (1912 y 1913) y más tarde F. y Mme MOREAU (1928) atacan los problemas de la sexalidad de líqenes y del origen del apotecio. HUE (1900) estdió la anatomía de nmerosos líqenes y propso na clasificación qe HARMAND aplicó a na importante obra de sistemática ( ). En 1907 y más tarde, entre , ZAHLLBRUCKNER reformó la clasificación de los líqenes teniendo en centa todos los factores, particlarmente de la afinidad del hongo. Es esta clasificación la qe es actalmente adoptada portodos. La biología y la qímica de los líqenes tomaron na importancia considerable. CHODAT(1913), JAAG (1929), RATHS (1938) y QUISPEL (1945) hicieron cltivos pros de gonidios de líqenes según las técnicas modernas, mientras qe MOLLER (1887), TOBLER (1909), WERNER (1927) e igalmente THOMAS (1939) y QUISPEL (1945) cltivaron de forma aislada ss hongos a partir de la espora para realizar la síntesis de líqenes. HESSE (1904), ZOPF (1907) y más tarde los japoneses ASAHINA y SHIBATA (1954) aislaron los prodctos qímicos elaborados por los líqenes y explicaron las reacciones de coloración qe descbrió NYLANDER.

28 . Introdcción 7 5 etapa: Natraleza mtalista o parasitaria de la simbiosis lipenica El término simbiosis, de origen griego, significa vida en conjnto y fe creado en 1879 por el botánico alemán DE BARY para caracterizar la asociación entre el alga y el hongo en el organismo compesto. En sentido amplio, la simbiosis abarca organismos viviendo en conjnto en asociación mtalista, comensalista o antagonista. La simbiosis mtalista implica la noción de aprovechamiento más o menos estrctrado por los dos compañeros, con el establecimiento de relaciones recíprocas. El comensalismo corresponde a nas relaciones de benos vecinos, bastante débiles, a veces más favorable a no de los asociados. La noción de agresividad aparece en la simbiosis antagonista: es el parasitismo. La simbiosis liqénica es n perpeto ballet de indcciones o de inhibiciones (recíprocas o nidireccionales) entre los asociados. Esta complejidad es ciertamente el origen de seis interpretaciones sobre la natraleza de la simbiosis, formladas desde 1869 hasta La Tabla 1 presme los conocimientos antigos y actalizados, además de los argmentos más avanzados. Hoy día, los investigadores contemporáneos mantienen la teoría de, o na simbiosis mtalista (HAWKSWORTH), o na simbiosis antagonista (AHMADJIAN). Las reflexiones de BOULLARD (citado por HALUWYN y LEROND en Gide des lichens (1993)) nos peden aydar a entender mejor esta dalidad de interpretación. Según la importancia asignada a no o al otro de dos asociados, el biólogo será incitado a notar calqiera cosa de armonía (mtalismo) o, al contrario, de conflicto (antagonismo). La existencia de lectinas de reconocimiento, prodcidas por el hongo para seleccionar n alga compatible (BUBRICK et al., 1981) pede transformarse en n ataqe parasitario si el alga no ha diferenciado n ligando de pared (MOLINA, 1995). Los trabajos de MOLINA y VICENTE (1995 y 1996) y MOLINA eta!. (1996 y 1997) aydan a entender más este tipo de relación entre los dos asociados del liqen y apoyan la teoría del origen parasitario de la simbiosis en n sentido amplio.

29 -4 Sc SO Ib -a -a Ib o o -a. Ib. a Ib ec, ago -loe e ece «9 ~1 e e e o a-.-, so o -J Ib a -.. O o -. ~0Q <be o. -l o. ce O-o e ae e e o e. ~.0 o --o o -, e e ~a,. e. e O -t C 09 O o. O- e a Ib O - O -~ >1 00 e aca~~ O e eee. e O e a-- <St O so Ib o </2 e e -o e -a ce 0Q~ o ~ e- o o, 00 a, o, O, e.~ ec 09 O ;- o e., e -a e o -o «9, E O Ib O E ~ -. a o E U, O so -J Ib 1 ~ cee e e -~ O O z o so e e 00 o o o 09 0 ee qq O a e e e tc~ 00 -J O e ~09 e- o. e.~09 c. E ~ ~acc e a O so 50 1< 4-4- ~0~ e O O- 0, N e O e O 09 o e o ab o o -a ~ e so a <.0 1$ -t e 0. e 0 O O ~ ~ OO O -t a e, m ~0 * ~1 O -o e Oe o -t -t e O. o <.0 e -l o Ib oc~ ce Oa <tao. 0 -a O ce. ce E~e 1 a e-a lee Hnr ~1 e O E e e e e O E o9 e -t >. e. e a Ib e o - a e e ~1 o e E o. e O 00 0 Ce ~-~~0 a O -~ a-. e. o a ~ o o e e o o Ib e o e -a a-. a- - ~0. o ee e E o e o.-. e 0>9> e o t e OO o <be O- e. -. e e O, e Ib E e 0. e Ib ;. 5. ~1 o a -o t.1 ;; ~. e 0. oc, O, e e 0 0- e 00 ae a Ib ~1 e e eco 000 -oo ~- e Oc E -aoqg e -t 09 a-o ~ Oc ~0 o o C. -. e o> (o pl. a o> Co o pl. o> o> a o> Co o> pl. -a pl. a o> o> 4 ichenologie de Des.4bbayes). U> a. o. <U o. o -I D NATURALEZA DE LA SIMBIOSIS LIOUENICA Actalmente 1951 (Trait de

30 Introdcción Definición de n liqen Desde BERKELEY (1869), citado por HALUWYN y LEROND en Gide des lichens (1993), hasta HAWKSWORTH (1988) la definición del liqen conoció n imnenso progreso y pasó de constatar qe era imposible dwerenciar los líqenes de los hongos a qe n liqen es na asociación estable, independiente, entre n micosimbionte y nfotosimbionte, en la cal el micosimbionte es el asociado qe rodea al otro. BELLEMÉRE (1973) propone de añadir en na estrctra original, el talo liqénico, porqe tiene nas características diferentes a la vez del talo de algas y del micelio de hongos. Esta definición insiste sobre la disposición estrctral de los asociados, noción qe no estaba integrada en la definición precedente de HAWKSWORTH et al (1983): n liqen es na asociación independiente entre n hongo (micobionte) y n alga o na cianobacteria (fotobionte). AHMADJIAN (1993) considera qe la definición dada por HAWSWORTH es a la vez desordenada y confsa en 2 pntos. Primero, porqe no reconoce el carácter único distintivo de los líqenes, cal es la notable transformación qe sfre el hongo cando se ne al alga. Según JAI-INS (1988), es el talo liqénico la estrctra qe diferencia entre hongo liqenizado y no liqenizado. Segndo, porqe la mayoría de los hongos penetran en las céllas del fotobionte. Técnicamente, por esta razón, según la definición de HAWSWORTH, el micobionte pede ser considerado tanto asociado interno como asociado externo. Para conclir, y despés de estas críticas dirigidas a HAWKSWORTH, AHMADJIAN da na neva definición del liqen: Un liqen es na asociación entre n hongo, generalmente n ascomiceto, pero en pocos casos n basidiomiceto o deteromiceto, y no o más asociados fotosintéticos, generalmente algas verdes o cianobacterias. En todos los líqenes, el hongo forma el talo o el estroma liqenizado qe pede tener compestos secndarios únicos Líqenes epifitos Ecología y ecofisiología de la implantación del epifito Epífitos son plantas no parásitas qe viven y crecen sobre otras, generalmente

31 Introdcción 10 plantas lefiosas. La clasificación de los líqenes epifitos se basa según s implantación en hojas, en la corteza o en la madera de las plantas leitosas. Entonces son folícolas, corticícolas o lignícolas. Según el desarrollo del talo en el interior o en el exterior de la corteza, las corticícolas se dividen en endoflóedicos y epiflóedicos. Estos últimos inclyen na serie de especies qe mestran na estrecha dependencia de sbstratos arbóreos, en mchas ocasiones de árboles específicos. De hecho, na de las características de referencia más claras para definir n liqen es s sstrato. Se ha~ descrito qe la textra de la corteza del hésped pede ser n factor determinante de la colonización: es más fácil qe las esporas fúngicas qeden atrapadas e inicien s desarrollo sobre sperficies rgosas (KALGUTKAR y BIRD, 1969; ADAMS y RISSER, 1971). También se ha comprobado qe son diferentes las comnidades liqénicas qe colonizan las zonas lisas o las rgosas de n mismo árbol (DEGELIUS, 1964; BRODO, 1968). JOHNSON (1940) sgirió qe la distribción de ciertos líqenes crstosos epifloédicos viene determinada por la disponibilidad de hmedad a partir de la corteza viva de los árboles y qe la absorción y acmlación de aga por estas cortezas depende de na serie de factores qímicos y estrctrales. DES ABBAYES (1932) determinó, en este sentido, qe esta capacidad es mayor en robles qe en pinos y qe la liberación de aga, desde la corteza, a potenciales epífitos cmple la misma relación. También se han establecido relaciones y diferencias entre Qercs vetlina y Qercs alba (HALE, 1955) o entre Pins albicalis y Larix lyalli (KALGUTKAR y BIRD, 1969). Inclso para el mismo árbol, MARGOT (1965) pdo determinar diferencias de hmedad en n gradiente descendente con la edad de los álamos y n continm de líqenes epifitos de acerdo con este gradiente. El tipo de líqenes qe colonizan cortezas de árboles también está en relación con la disponibilidad de electrolitos, qe pede reflejarse en el contenido en cenizas de dichas cortezas. También se ha adcido en n ben número de casos qe el ph de la corteza actúa como factor de selección de la especie particlar de epifito. Se peden encontrar

32 Introdcción 11 diferencias notables de ph entre grandes grpos de árboles. Mientras qe la mayor parte de los de hoja cadca tiene n ph en corteza entre 4,5 y 7, las coníferas lo tienen más bajo, entre 3 y 5 (HALE, 1983). Un efecto primario del ph pede ejercerse sobre la germinación de esporas ffingicas y sobre el crecimiento de algas de vida libre, potenciales formadores de asociación simbiótica. El ph óptimo para el crecimiento de las algas sele ser cercano a la netralidad, por tanto, diferente al de la corteza y al óptimo de germinación de las esporas (GROSS y AHMADJIAN, 1966) Sstancias liqénicas Denominación y natraleza de sstancias liqénicas PFAFF (1826) aplicó el nombre de ácidos de líqenes a todas las sstancias qímicamente definidas, elaboradas en el talo y siempre, al menos al final, excretadas al exterior de hifas. Los atores de lenga alemana designaron estos ácidos liqénicos bajo el nombre de Flechtenstoffe qe significa sstancias qímicas de líqenes, nombre más general y más correcto qe el de ácidos porqe si algnos son verdaderos ácidos otros son netros (DES ABBAYES, 1951). CULBERSON (1969) aplicó n nevo término llamando a dichas sstancias, sstancias o prodctos liqénicos; sin embargo este término tenía el mismo sentido qe los anteriores, porqe abarca toda clase de sstancias orgánicas encontradas en dichas plantas. VICENTE (1975), considerando qe este nevo término es ambicioso y también eqívoco, se limita, llamando sstancias liqénicas sólo a los grpos de compestos qe sean absoltamente específicos de liqenes, qe únicamente estas plantas los contengan y qe sólo ellas pedan sintetizarlos. Estas sstancias, qe son exclsivas de la simbiosis liqénica, inclyen catro tipos de estrctras: dépsidos, depsidonas, dibenzofliranos, y ácidos úsnicos, todos ellos compestos polifenólicos de origen común a partir de ácidos carboxílicos policetónicos derivados del ácido acético.

33 Introdcción Localización y 12 concentración Las sstancias liqénicas se diferencian del resto de los componentes fenólicos vegetales por s particlaridad de considerarlos como prodctos extracellares (HALE, 1967, 1974; HAWSWORTH, 1976), ya qe, siendo sintetizadas por las hifas del micobionte, son excretadas y depositadas como cristales sobre s sperficie antes qe ser retenidas dentro de las céllas. Sin embargo, otros compestos fenólicos vegetales tienen siempre localizaciones intracellares, bien diseltos en el citoplasma o internalizados en vacolas, como los flavonoides, bajo forma de peqeitas vesíclas citoplásmicas qe encierran y aíslan en s interior los taninos, bien como vesíclas o láminas localizadas en el citoplasma periférico o nidas a la pared cellar, como las ligninas. La irreglaridad de los líqenes dentro del reino vegetal no sólo viene de la prodcción de las sstancias liqénicas, sino también por la alta concentración de ellas qe pede almacenar el talo. Esas sstancias peden jgar n papel my importante en la resistencia de los líqenes contra las invasiones bacterianas debido a s carácter antibiótico. Como ejemplo de esa alta concentración, el ácido norstíctico qe pede representar hasta el 6 por 100 del peso seco del talo liqénico. Otro de los papeles más importantes qe tienen las sstancias liqénicas en particlar, y los prodctos secndarios en general, especialmente compestos aromáticos, es s aplicación taxonómica (HAWSWORTH, 1976). Por ejemplo el ácido rodocladónico es característico de la familia Cocc¼raey la aparición de parietina es característica de la familia Teloschistaceae. Por último, hay na serie de derivados fenólicos qe sólo han sido encontrados, por lo menos hasta hoy, en líqenes y cyo origen es común a partir de ácidos carboxílicos policetónicos, derivados del ácido acético. Estos ácidos, de cadena abierta, se ciclan de dos formas distintas para dar dos nidades fenólicas básicas. El primer tipo de ciclación sige el modelo del ácido orselínico, primer ácido fenólico qe es la base estrctral de dépsidos, depsidonas y dibenzofranos. El segndo tipo de ciclación sige el modelo de floroglcinol, constityendo la base estrctral de los ácidos úsnicos.

34 Introdcción Biogénesis de las sstancias liqénicas (véase Fig. 1) Importancia de las sstancias liqénicas El liqen, siendo na nión compacta y sólida entre dos asociados, aprovecha de las sigientes características de ss específicas sstancias liqénicas: - Hidrofobia: las sstancias liqénicas contribyen al mantenimiento del eqilibrio hídrico del talo limitando la evaporación del aga en la sperficie del mismo y controlando las vías de transferencia al interior del talo (ARCHER, 1981). - Propiedades qelantes: los líqenes peden asegrar na determinada protección por qelación de metales pesados, sobre todo los presentes en el medio (SYERS e ISKANDAR, 1973). - Absorción de radiaciones lminosas: La variación de la intensidad y coloración de talos de Xanthoria parietina en fnción de los rayos solares es el resltado de na variación de concentración en parietina (SCOTT, 1971). Así se asegra la protección del alga asociada en líqenes contra las radiaciones lminosas (MATEOS et al., 1993). - Conversión de radiaciones lminosas: con la presencia de atranorina en la corteza sperior, las longitdes de onda no sados por el fotosimbionte se convierten a longitdes útiles (HENSSEN y JAHNS, 1974). - Reglarización de la actividad fotosintética del alga: las sstancias liqénicas reglan la actividad fotosintética del alga según diversos mecanismos todavía mal elcidados. Permiten al micosimbionte de mantener la población algal en na capa de espesor niforme a lo largo de la vida del talo (HONEGOER, 1987). - Propiedades antibióticas: las sstancias liqénicas inhiben la germinación de semillas (NISHITOBA et al., 1987), pero no es na norma absolta. En ciertos casos peden estimlar la germinación (DAURIAC y RONDON, 1976). Esta acción inhibito-

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36 15 Introdcción na se observa sobre las esporas de briofitos (BUSTAMANTE et al., 1989) y hongos (TOLPYSHEVA, 1984 a,b), también sobre otros líqenes. Además, mchos fenoles liqénicos son activos antibióticos frente a bacterias Gram+ (BUSTINZA y CABALLERO, 1947; PEREIRA et al., 1994). Las propiedades medicinales, ntricionales y odoríferas de las sstancias liqénicas en particlar y de los líqenes en general feron descritas por RICHARDSON (1988). Los liqenólogos las san como na base para la taxonomía Relación del liqen con el fitóforo DeI epifitismo al parasitismo. La antiga idea de qe los líqenes epífitos no casan daño a los héspedes está siendo actalmente criticada a la lz de los descbrimientos realizados en los últimos años. Inclso SMITH (1921) afirma textalmente: Prácticamente todos los líqenes cortícolas son epífitos y el daro qe casan es de natraleza accidental. Las especies crstosas sobre la madera externa ocpan las capas corticales mertas y parecen ser enteramente inofensivas. Lasformasfoliosas yfrcticosas no son tan inocas: a casa de n abndante crecimiento envolvente estorban la entrada de aire y hmedad y por tanto, impiden la vida vegetal qe los soporta. Mchos de estos epifitos realizan n aténtico ataqe parasitario sobre ss fitóforos, gracias a la inyección de fenoles en el xilema. Estos fenoles serían transportados acrópetamente hasta las hojas provocando desfoliación, en mayor o menor extensión, según la densidad de cobertra sobre tronco y rama. ASAHINA y KUROKAWA (1952) feron los primeros en describir tal inhibición del desarrollo de ejes calares de té por líqenes epífitos. BROWN y MIKOLA (1974) observaron n descenso en la velocidad de crecimiento de Pins sylvestris, casado, probablemente, por la acción inhibidora de los líqenes terrícolas sobre la asociación de los raíces del pino con micorrizas.

37 Introdcción 16 HALE (1983), despés de n considerable número de observaciones en el campo, llegó a pensar qe el crecimiento de epifitos sobre el fitóforo provoca na sensible pérdida de vitalidad. En el mismo sentido, VICENTE (1988) observó qe na densa población de líqenes implantados sobre ramas de Qercs rotndwolia condce a la falta de hojas, sin qe ello peda ser atribido a la edad de la rama y qe este efecto es particlarmente dramático en arbstos jóvenes, en los qe la invasión por liqenes coincide con na atrofia del individo. También en las ramas con abndante cobertra liqénica se observa na redcción de volmen respecto a las ramas libres de epífitos, qedando aqellas redcidas a la mitad o a la tercera parte del espacio ocpado por estas últimas. AVALOS et al (1986) demostraron la presencia de los ácidos evérnico y evernínico en ramas de encina poblados por Evernia prnastri y Ramalina calicaris, qe peden translocarse vía xilema hasta alcanzar las hojas. FOLLMANN y PETERS (1966), PYATT (1967), RAMAUT y THONAR (1972 a,b), DAURIAC y RONDON (1976), demostraron bajo condiciones del laboratorio, la toxicidad de las sstancias liqénicas. OZENDA y CLAUZADE (1970) especifican qe las interacciones entre los líqenes epífitos y ss fitóforos se peden acompañar con la difsión de sstancias liqénicas ejerciendo na acción fitocida para el hésped, con referencia a los ácidos seqicaico y úsnico, prodcidos por el liqen tropical Ramalina tayloriana Penetración del epifito en el sstrato La penetración de los líqenes epífitos en s fitóforo fe n tema abordado desde finales del siglo XIX y fertemente controvertido, sin qe, hasta my pocos años, se aportaran prebas definitivas a este respecto. La cestión estaba planteada entre dos extremos: o bien se trata de na penetración activa qe alcanzaba tejidos vivos, o bien sólo na penetración sperficial, a través de heridas y lenticelas sin alcanzar el tejido vivo profndo.

38 Introdcción 7 FRANK (1877) y BONNIER (1889) feron los primeros en describir cómo las hifas de Trentepohlia llegaban hasta la peridermis de s hésped, provocando rptra de las membranas y de las paredes cellares. LI?NDAU (1904) demostró qe los líqenes epífitos penetraban hasta la peridermis del fitóforo, creciendo entre ss céllas por simple presión mecánica sin perforar las paredes cellares. PORTER (1917) describía cómo hifas de Ramalina penetraban en s hésped a través de la corteza, cortex, floema y cambim. BRODO (1973) considera qe los líqenes epífitos peden penetrar en distintos grados en los tejidos del fitóforo. ESTÉVEZ et al (1980) demostraron, por la aplicación de técnicas de coloración para hongos parásitos realizados en cortes de ramas de Fags sylvatica, sando la zona de inserción de Evernia prnastri, la existencia de na penetración periférica qe, comenzando a través de heridas sperficiales y lenticelas, invadía la peridermis y llegaba inclso hasta los vasos condctores del xilema. El mismo año, ASCASO et al (1980) realizaron cortes extrafinos secenciados desde el pnto de inserción del mismo liqen en ramas de Qercs pyrenaica en sección transversal, cya observación al microscopio óptico demostró qe las hifas liqénicas atravesaban las capas sberificadas de la corteza, destryendo las céllas del hésped. Usando tanto el microscopio electrónico de transmisión (MET) como el microscopio electrónico de barrido (MEB), ORUS y ASCASO (1982) describieron similares resltados para Evernia prnastri epifito sobre Qercs rotnd.ifolia, donde las hifas feron halladas en el interior de los elementos floemáticos, con claras indicaciones de penetración activa a través de ss paredes cellares. BELLEMÉRE (1973) demostró qe mchos ascomicetos parásitos contienen los cerpos concéntricos cya natraleza, aún hoy, es desconocida. Esos mismos cerpos concéntricos feron encontrados jstamente en las hifas en el pnto de inserción del liqen sobre la corteza del árbol (ASCASO et al., 1980). MOISSEJEVA (1961) seitaló la abndante prodcción de enzimas extracellares por parte del liqen en las zonas del talo en contacto más estrecho con sstrato, lo qe sgiere la existencia de, no solamente na penetración fisica, sino también na penetración qímica de las hifas del liqen en los tejidos, sigiendo na pata

39 18 Introdcción enzímática semejante a la desarrollada por hongos parásitos y prodciendo enzimas cellasa y poligalactronasa, capaces de degradar las paredes cellares primarias y secndarias del fitóforo. Se han detectado en líqenes las actividades /3-1, 4-glcanasa (ESTEVEZ y ORUS, 1981), y poligalactronasa (YAGÚE et al, 1984), ambas indcibles y parcialmente segregables al medio de incbación. VICENTE (1988) sospechó qe na /3-1, 4-glcanasa preexistente, parcialmente inactiva, pdiera ser activada mediante n factor proteico, o dependiente de na proteína, cya síntesis sería impedida por cicloheximida, en lgar de existir na aténtica indcción de la glcanasa. Esta sospecha venía apoyada por el hecho de qe na endoglconasa de Evernia prnastri era rápidamente activada tras hidratación del talo mientras qe s deshidratación casa na drástica pérdida de la actividad enzimática (YAGÚE, 1987) Interacciones ntricionales entre líqenes epífitos y s fitóforo Cando se habla de relación de los epífítos con s fitóforo, la interacción ntricional sería el ben ejemplo para definir y aclarar tal relación. Se ha comprobado qe la mayoría de los azúcares y carbohidratos qe tiene el liqen son semejantes a los qe existen en la corteza del árbol (SRIVASTAVA, 1945 y 1964). SMITH (1962) demostró, en cltivos iii vitro, qe los líqenes son capaces de tilizar na amplia gama de compestos orgánicos de carbono y nitrógeno, sin olvidar qe el ficobionte del liqen, siendo n cloroficea, es incapaz de fijar el nitrógeno atmosférico. SOLBERO y SELMER-OLSEN (1978) encontraron altos contenidos de mercrio en especies de Alectoria. Un año más tarde, SOLBERG (1979) trabajando sobre talos de Alectoria fremontii y troncos de s sstrato Pintes sylvestris, demostró qe la acmlación de iones por el liqen epifito estaría más relacionada con el aporte de lixiviados por el aga de llvia, qe escrre por el tronco qe con la composición iónica de la propia corteza. PIKE (1978) logró resltados concordantes para diferentes especies liqénicas qe crecían en bosqes Psedotsga inenziesii, Abies balsamea y Acer saccharm. En general, los líqenes sitados en la porción más baja del dosel arbóreo pierden minerales por lixiviación más rápidamente qe los líqenes qe crecen en la

40 Introdcción 9 parte sperior de aqel. Sin embargo, el aga de llvia, lixiviando minerales de las hojas de los árboles, pede sbvenir a ciertas necesidades ntricionales de los epífitos. La relación ntricional con el aga de llvia fe también encontrada por BOSSERMAN y HAGNER (1981). Sin embargo, trabajando con especies de Usnea y Parmelia qe crecían sobre cipreses y sobre arbstos demostraron qe los epífitos contenían mayoritariamente los elementos principales del sstrato Liqen epifito: Everniaprnastrí (L.) Ach Características diferenciales Evernia prnastri, llamado vlgarmente msgo de encina >, tiene n talo ramificado, aplastado en tiras y na estrctra parecida al tipo estratificado, pero carece de rizinas y fijado al sstrato por n pnto terminal. La composición mineral de Evernia prnastri inclye principalmente sílice, sodio, magnesio, cloro, y potasio. También tiene, pero en cantidades bajas, slfato y fosfato. Esta composición pede variar en proporción según el tipo de sstrato. Las sstancias de reserva, como hemicellosa para las plantas speriores, son polímeros formados por diversas mezclas de galactosano, manosano y dextrosano, qe selen estar localizadas sobre todo en paredes de las hifas medlares (TEIXEIRA et al., 1994). La posición de la especie Evernia prnastri (L.) Ach. fe realizada por OZENDA y CLAUZADE (1970) de la sigiente manera: Clase: Ascolíqenes Sbclase: Discolíqenes Orden: Cyclocarpales Sborden: Lecanorinae Familia: Género: Especie: Usneaceae Evernia Ach Everniaprnastri (L.) Ach

41 Introdcción 20 Evernia prnastri es n liqen epifito principalmente corticicola de árboles y arbstos, excepcionalmente lignícola, saxícola o terrícola. Es na especie qe se ne al sstrato mediante prolongaciones de las hifas de córtex (SCOTT, 1971; SEAWARD, 1977). Especie más o menos fotófila, acidófila, prefiere cortezas qe van desde netras a my ácidas: ph de 5,6 a 3,4; anitrófilas o moderamente nitrófilas. De clima templado y ombroclima predominantemente húmedo y con algnos enclaves sbhúmedos, no existiendo en los áridos Sstancias liqénicas características Las sstancias liqénicas aisladas de Evernia prnastri han sido citadas por CULBERSON (1969 y 1970) y CULBERSON et al. (1976). Tales sstancias son atranorina, cloroatranorina, ácido úsnico y ácido evérnico (Fig. 2). Estos ácidos carboxílicos policetónicos derivados del ácido acético, de cadena abierta, se ciclan de dos formas distintas para dar dos nidades fenólicas básicas. El primer tipo de ciclación sige el modelo del ácido orselínico, primer ácido fenólico qe es la base estrctral de dépsidos, depsidonas y dibenzofranos (ácido evérnico, atranorina y cloroatranorina). El segndo tipo de ciclación sige el modelo de floroglcinol, constityendo la base estrctral de los ácidos úsnicos. Se habla de compestos de la serie del orcinol cando el ácido orselinico es la base fenólica estrctral para la formación de dépsidos y depsidonas, y de la serie de 3orcinol si, además del prodcto de ciclación orselínica, presenta n sstityente de n solo átomo de carbono en la posición 3 del anillo A (3 del anillo B), siendo este compesto la base estrctral de dépsidos y depsidonas. El ácido evérnico es p-dépsido de la serie del orcinol, mientras qe la atranorina y la cloroatranorina son p-depsidos de la serie 3-orcinol Relación con el fitóforo Según estdios realizados por LINDAU (1895), fe demostrado qe el talo de

42 21 Introdcción H~Ñ 0~.~~~~~ /CH 3 o c 0¾ CH3 Ácido Úsnico Q HO OHC CH3 H3C COO Q OH OH COOCH3 CH, Atranorina CI CH, H,C Q HOQ OHC OH OH CH, Cloroatrwiorifla CH, CH,O COO OH OH COOH CH3 Acido evérnico Fig. 2. Sstancias liaénicas de Evernia yrnastri (L.> Ach

43 Introdcción 22 Evernia prnastri está nido al sstrato por aprehensorios qe envolvían n sbstancial grado de penetración. No obstante, LINDAU especificó qe no feron observadas hifas fera de los límites de las céllas peridérmicas mertas. Mchos atores apoyaron este pnto de vista. Solamente no, PORTER (1917), trabajando con Ramalina, género filogenéticamente cercano a Evernia, describió na extensa penetración de las hifas de esta especie en la madera de s sstrato hasta alcanzar el cambim. Las principales vías de penetración para las hifas son tanto las heridas como las lenticelas y siendo los espacios intercellares las únicas vías para s desarrollo posterior. Los estdios de ESTEVEZ et al (1980), aplicando los métodos de tinción de hongos parásitos en ramas desgajadas de Fags sylvatica, describieron, en los pntos de inserción del liqen con la rama, n cierto grado de penetración en la madera a través tanto de heridas como de lenticelas. En otros casos, la penetración de las hifas se lleva a cabo atravesando tejidos intactos y invadiendo los espacios próximos. El mismo año, ASCASO et al. (1980) estdiaron, mediante cortes ltrafinos observados al microscopio electrónico, el efecto de Evernia prnastri creciendo sobre ramas de Qercs pyrenaica, estdios qe reafirmaron los resltados anteriores en la peridermis. A nivel vasclar se encontraron hifas tanto en los espacios intercellares como en el interior de las céllas, principalmente dentro de los elementos xilemáticos. Por otra parte ORUS y ASCASO (1982) y ASCASO (1985) encontraron hifas de Evernia prnastri en el interior de los vasos condctores de Qercs rotncftfolia, sando tanto el microscopio óptico, como el microscopio electrónico de transmisión y de barrido, con la aparición frecente de cerpos concéntricos típicos del estado de simbiosis en el pnto de inserción del liqen sobre la corteza del árbol, y con claras indicaciones de penetración activa a través de ss paredes cellares y relacionaron dicha cobertra liqénica con fenómenos de desfoliación del fitóforo. Además de la penetración fisica de las hifas liqénicas, ESTEVEZ y ORUS (1981), comprobaron qe Evernia prnastri presenta actividad /1-J,4-glcanasa indcible y segregable, capaz de degradar la cellosa. Posteriormente YAGUE (1987) indicó la posible localización de na /3-J,4-glcanasa de Everniaprnastri preexistente activada por hidratación del talo. ESTEVEZ et al. (1982) observaron, en condiciones natrales y simladas, la aparición de na intensa desfoliación de ss ramas densamente cbiertas del liqen, atribyéndola a la inclsión de las sstancias liqénicas de Everniaprnastri en el fljo xilemático de

44 Introdcción 23 Qercs rotndifolia. ORUS et al. (1981a) estdiaron los efectos de la inclsión de las sstancias liqénicas aisladas de Evernia prnastri (los ácidos evérnico y úsnico, atranorina y cloroatranorina) y llegaron a observar qe, en condiciones de laboratorio, estas sstancias liqénicas interfieren en procesos fisiológicos foliares de fitóforo como la inhibición de la actividad fotolítica como consecencia de la qelación del manganeso cloroplástico. Semejantes experimentos tvieron como resltados la alteración del metabolismo del almidón provocada por na carencia energética (ORUS et al., 1981b) y envejecimiento de los tejidos foliares, detectado a diferentes niveles (ASCASO eta)?, 1981). ASCASO et al. (1983) estdiaron la relación entre la pérdida de capacidad fotosintética y desfoliación, tratando los cloroplastos de Qercs rotndifolia con las sstancias liqénicas de Evernia prnastri y observaron qe presentan estroma y grana irreglares con frecente pérdida o rptra de las estrctras granales. El efecto de na densa población de epífitos dominada por Evernia prnastri sobre cloroplastos foliares de Qercs pyrenaica y Qercs rotndifolia mediante microscopio electrónico de transmisión y análisis de imagen, fe estdiado por ASCASO y RAPSCH (1986a), qienes demostraron qe la presencia de dichos epífitos disminye el contenido foliar de clorofilas hasta n 50 % aproximadamente así como amenta de forma notable el contenido de almidón, del orden de dos veces sperior en roble y 10 veces sperior en encina respecto a los controles sin epífitos. En el mismo año ASCASO y RAPSCH (1986b) llegaron a constatar qe la incbación con ácido evérnico deprime todas las relaciones estrctrales del cloroplasto analizadas como el área, perímetro, porcentaje de almidón, número de plastoglobúlos, grana por cloroplasto y tilacoides por grana. Sin embargo, los resltados logrados por AVALOS et al. (1986) demostraron qe en ramas de Qercs pyrenaica cbiertas por Evernia prnastrí, el ácido evérníco es acrópetamente translocado a través de los vasos xilemáticos hasta alcanzar el nervio principal de las hojas, pero este ácido fenólico no fe detectado en el mesófilo de las hojas.

45 Introdcción 24 El efecto sobre el número y la velocidad de desarrollo de yemas foliares de Qercs pyrenaica soportando poblaciones de Evernia prnastri y Parmelia slcata fe estdiado por LEGAZ et al. (1988) comprobando qe tanto las ramas primarias como secndarias qe soportan epífitos forman menos yemas y, de éstas, se desarrollan menos hojas y más tardíamente qe aqellas libres de epifitos. Aqellas yemas retrasadas contienen discretas cantidades de ácido evérnico sstancia liqénica qe ha podido ser aislada y caracterizada de dichas yemas, tanto por HPLC como por espectro IR (VICENTE, 1988). Semejantes resltados feron logrados por MONSÓ et al. (1993) qe llegaron a constatar qe la acmlación del ácido evérnico en yemas apicales de ramas de Betla pendla Roth. pede inhibir el crecimiento apical de las ramas y la aparición de hojas, en el mismo sentido de lo descrito por LEGAZ et al. (1988) trabajando con Qercs pyrenaica Willd FISIOLOGÍA Y ULTRAESTRUCTURA DE LA DESFOLIACIÓN ASCASO et al. (1983) observaron nas alteraciones ltraestrctrales en cloroplastos de hojas de Qercs rotndifolia despés de incbarlos con componentes natrales aislados de Evernia prnastri. VICENTE y ESTEVEZ (1976) estdiaron la acción de cloroatranorina en la inhibición de fotolisis por qelación de Mn2~. ORUS et al. (1981a) encontraron qe las sstancias liqénicas, aisladas de Evernia prnastri y sministradas, bajo condiciones de laboratorio, a extremos apicales de ramas de encina cortadas y portando hojas, inhiben la fotorredcción del DCPIP y lo hacen a na velocidad 10 veces menor qe aqellos procedentes de ramas no tratadas. Sin embargo, la reacción de HILL fe completamente restarada cando los cloroplastos deficientes feron incbados con MnCl 2~ cloroplástico, casado por 2. El presmible deficit de Mn fenoles, fe confirmado mediante la valoración del catión por espectrofotometría de absorción atómica, lo qe confirmó qe las sstancias liqénicas absorbidas, en la zona de corte, debían ser translocadas a las hojas donde, qelando el Mn2~ cloroplástico, determinarían la depresión fotosintética. Experimentos semejantes feron reprodcidos por INOUE et al. (1983) sando cloroplastos aislados de hojas de Qercs mongolia qe procedían de ramas incbadas en bicarbonato 1 mm qe contenía ácido úsnico 40 jm en acetona al 2%. Al cabo de 7 días, la actividad de los cloroplastos en la

46 Introdcción 2S fotonedcción de DCPIP decreció al 20% de la actividad control, siendo parcialmente restarada por adición de MnCl2. Un fenómeno semejante fe observado cando se midió la fotoprodcción de oxígeno sando fenicianro como aceptor de electrones. El ácido úsnico inhibía fertemente el desprendimiento de oxígeno, el cal era parcialmente restarado por adición de MnCl2 0,2 mm. Estos resltados feron más tarde refrendados por INOUE et al. (1987), anqe LASCÉVE y GAUGAIN (1990) trabajando con plantúlas de girasol y maíz, y VAVASSEUR et al (1991), sando protoplastos de céllas mesofilicas de Commelina commnis, encontraron qe la 2~ no era posible. La reversión de la inhibición de la fotolisis por adición de Mn inhibición de la fotosíntesis en estas plantas parecía deberse a n cierre parcial de los estomas prodcido por el ácido úsnico lo qe recndariamente inhibía el fljo de CO 2. Sin embargo, INOUE sgiere la existencia de varios problemas. Uno de ellos consiste en qe los efectos inhibitorios del ácido úsnico dependían de la edad de las hojas, ya qe el éxito en los experimentos se lograba sando ramas jóvenes, pero no scedía en ramas viejas. Otro problema radicaba en qe los resltados obtenidos con roble no eran reprodcibles sando hojas de espinaca. La acción del ácido úsnico podía ejercerse tanto en el centro redctor como en el oxidante del PSII, dado qe la florescencia de las clorofilas amentaba en periodos cortos de ilminación y disminía en el estado estacionario, en cloroplastos tratados respecto de los sados como control. Esto pede interpretarse, en el sentido antes apntado, como na inhibición semejante a la inhibición lograda con herbicidas de la familia de la atrazina o del DCMU (PFIOSTER et al., 1981). Esta sposición se ve reforzada por ácido úsnico cando se san cloroplastos de espinaca insensibilizados frente a DCMU, siendo así qe la misma concentración del fenol casa n 50% de inhibición del proceso en cloroplastos no insensibilizados (IiNOUE et al., 1983). Un pnto interesante concierne a la metodología empleada. La nión de 4C-atrazina a la proteína asociada a la plastoqinina B, (Qn), entre el aceptor primario y el bloqe de plastoqinonas, envelve el mismo número de moléclas de clorofila, tanto en tilacoides aislados de cloroplasto como en aqellos aislados de cloroplastos deprimidos en s contenido en bicarbonato o, inclso, en estos últimos cyo nivel de bicarbonato ha sido artificialmente restarado (KAHNNA et al., 1981). En los tres casos, n sitio de nión para el herbicida conlíeva 500 moléclas de clorofila. Sin

47 Introdcción 26 embargo, sí cambian sensiblemente los valores de la constante de afinidad en los tres casos. Estos valores han sido estimados en 3,4 iot 1,2 í07 y 4,8 108M, respectivamente. Esto implica qe, en las mestras deprimidas en bicarbonato, la afinidad de atrazina por s centro de nión se ve sensiblemente redcida. Parece qe la falta de bicarbonato pede cambiar la concentración de la proteína a la qe se ne el herbicida cerca del centro redctor del PSII, condciendo esto a n cambio en la afinidad de la proteína por s ligando. Despés de adición de bicarbonato a los tilacoides deprimidos en dicho anión, se restara la afinidad por la atrazina y se hace comparable a la del control. Semejantes resltados han sido obtenidos para DCMU y para 4,6-diitro-O-cresol (VAN RENSEN y VERMAAS, 1981; GOVINDJEE a al., 1983). Estos resltados ponen la cestión en na doble disyntiva: a) Si el ácido úsnico en particlar, o los fenoles en general, tienen na acción desacoplante semejante a la de los citados herbicidas, el smiistrarlos diseltos en bicarbonato sensibiliza a la proteína a QB frente a dichos fenoles. b) Cabría pregntarse si la disolción de fenoles tilizada en los experimentos de simlación es eqiparable a la qe, de na manera natral, pede encontrarse en el flido xilemático del fitóforo MECANISMO DE LA FOTOSÍNTESIS EN PLANTAS SUPERIORES El conocimiento científico de las ferzas qe gobiernan el movimiento empezó hace casi 4 siglos con los descbrimientos de GALILEO, PASCAL, NEWTON y ss scesores. Pero esas leyes qe sólo trataron n terreno de energía, qe es el movimiento de masas, no aportaron casi nada a la comprensión de la vida. Había qe esperar la termodinámica, con CARNOT y JOULE, para qe el concepto de energía deja atrás la noción de energía cinética y reúne poco a poco el calor, la lz y, de manera general, los rayos.

48 27 Introdcción A partir de aqí, se podía explicar cómo los organismos vivos sobreviven gracias a la propiedad qe tienen de convertir la energía captada de fentes exteriores. Al principio de la vida había sólo na fente de energía exterior: el Sol. Los organismos vivos más sencillos se contentaron sando los mejores rayos qe cbrieron na my larga banda en el terreno electromagnético. El ejemplo de los vegetales mestra qe el problema ha sido reselto de manera satisfactoria, almacenando esa energía bajo forma qímica estable asegrando s vida y permitiendo a otras formas vivas de desarrollarse sin tener qe captrar las radiaciones solares. El proceso mediante el cal esos vegetales transforman la energía lminosa en energía qímica, qe nos pede garantizar qe la vida sobre la Tierra no llega a s fin por falta de energía, es a la vez distintivo y definitorio del reino vegetal, es la fotosíntesis. Este proceso biológico capacita al organismo para tilizar lz visible o infrarrojo-cercana como fente de energía metabólica y qe, por tanto, le permite ntrirse de compestos minerales con bajo o nlo contenido energético. La primera etapa de este proceso biológico consiste en la absorción de n fotón por n pigmento orgánico organometálico (na clorofila o n carotenoide) qe pasa a n estado electrónicamente excitado desde el qe es posible iniciar na serie de transformaciones fisicas y qímicas especificas. Como resltado de tales transformaciones se prodcen redctores y estados ricos en energía (NADPH, ATP, etc.), y s segnda etapa consiste en la tilización de tales formas de energía por el anabolismo cellar El cloroplasto fncional Se define fotosíntesis al margen de la fotoergonia de Halobacterim halobim para significar qe fotosíntesis implica no sólo formación de ATP acoplada a procesos fotoqímicos, sino también reacciones de redcción dependientes de la capacidad de formar ncleótidos de piridina, qe seran empleados como cofactores por parte de

49 Introdcción 28 enzimas del metabolismo del carbono y del nitrógeno. Sobre esta base, la fotosíntesis reqiere n donador de electrones, como es el aga en plantas speriores. Al prodcirse oxígeno tras la cesión de electrones a pigmentos fotooxidados, la fotosíntesis recibe el nombre de oxigénica, para diferenciarla de aqella qe, como en bacterias, el donador de electrones es slfro o sccinato y, por tanto, no conlíeva despendimiento de oxígeno. Los fotorreceptores fotosintéticos son siempre clorofilas a, a las qe se asocian pigmentos accesorios, como carotenos, xantofilas y biliproteinas, para constitir fotosistemas Constitción de fotosistemas para fotosíntesis oxigénica Las clorofilas de lamelas cloroplásticas lavadas son my resistentes a la extracción con tampones acosos. Las membranas lipoproteicas son solbilizadas, sin embargo, con na amplía variedad de detergentes, como desoxicolato, sin embargo, Triton X-100, dodecil slfato sódico, etc. Mediante estos tratamientos, peden separarse distintos complejos clorofila-proteína qe peden ser posteriormente caracterizados en SDS-PAGE. Se observan seis bandas distintas qe contienen clorofila, pero peden agrparse en tres únicos y diferentes complejos clorofila-proteína, además de definir la séptima banda como n artefacto formado por la interacción entre el detergente y la clorofila. Las bandas CP1a y CPl sólo contienen clorofila ajnto con P700, el centro de reacción del fotosistema 1 (PSI). Las bandas LHCP contienen clorofilas a y b casi en idéntica proporción, y s fnción la de acmlar energía (Light-HarvestingChlorophyll-Protein complexes). La banda CP4 contiene sólo clorofila a, pero s máximo de absorbancia en el rojo está desplazado hacia longitdes de onda más cortas qe las encontradas como dominantes en CP1 y CPía, por ello, parece estar asociada al centro de reacción del fotosistema II (PSII). Los complejos clorofila-proteína qe integran el PSII han podido ser aislados y caracterizados a partir de cierto número de plantas speriores (BASSI y SIMPSON, 1989b). Membranas de maíz qe contienen PSII han sido solbilizadas con

50 Introdcción 29 octilglcósido y han podido ser analizadas en electroforesis no desnatralizante. El denominado complejo LHCI-680 es disociado en SDS-PAGE en dos polipéptidos de 20 y 25 kda de masa moleclar. S máximo de absorción está localizado a 669 nm, emitiendo florescencia con n máximo a 680 nm. El complejo Chl~,-P2 también está compesto por dos polipéptidos de masa moleclar my cercana, 28 y 29 kda, con n máximo de absorción a 671 nm y n máximo de florescencia a 680 nm. Un solo polipéptido parece estar formando el complejo denominado Chlwb Pl, de 31 kda de masa moleclar, con características espectrales my semejantes a las dos anteriormente citadas. La mayor banda, denominada Chlañ,~~P2**, cya masa moleclar en condiciones no desnatralizantes se ha estimado en 143 kda, disocia en SDS-PAGE en cinco bandas polipeptídicas de 26; 28,5; 28,8; 29,5 y 30 kda. S máximo de absorción está en 674 nm, emitiendo florescencia a 680 nm. Todos estos complejos clorofila-proteína están compestos por ambas formas del pigmento, a y b, con razones qe varían desde 1,2 para ChLvP2** a 2,5 para el complejo Chl~ Pl. Además de los descritos, se han aislado complejos qe sólo contienen clorofila a. los complejos denominados Chla-P2 y Cha-P3 están asociados claramente al centro de reacción. Este último ha sido preparado tanto a partir de espinaca como de maíz. En s forma de máxima desociación consta de 5 polipéptidos. El de mayor tamaño, Chla-P2, de nos 45 kda, contiene clorofila a. dos polipéptidos, denominados D1 y D2 de masas moleclares entre 29 y 36 kda, parecen asociarse a transportadores (KLEIN et al., 1993). Las dos últimas bandas corresponden a n citocromo b559, de 9 kda, y n peqeño péptido de 4 kda. Este complejo es capaz de transportar electrones desde la 1 >5-difenilcarbacida al DCPIP. Sin embargo, na mayor desagregación se ha logrado sando PSII de espinaca. El complejo, qe es básicamente idéntico al de maíz, separa na fracción más simple, compesta exclsivamente por los péptidos D1 y D2, así como de citocromo b599 El análisis por HPLC de esta partícla, considerada como fotocentro del PSII, revela qe contiene 5 moléclas de clorofila a, dos de feofitina a, na molécla de 3-caroteno y na de citocromo b559. Este complejo, prificado, no fotorredce DCPIP a partir de 1,5difenilcarbacida, pero mestra cambios drásticos de absorción tras ilminación en presencia de metil viológeno y ditionito. Un pico negativo a 682 nm en el espectro

51 30 Introdcción diferencia lz oscridad revela la presencia de P680, mientras qe el pico positivo a 450 nm pede interpretarse como acmlación de feofitina redcida. Cando la disociación de PSII de maíz por octilglcósido se lleva a cabo en presencia de Mg» y en gradiente de sacarosa, se separan tres bandas qe indican estabilidad interna de sbeomplejos. El Mg2~ es reqerido para la asociación de los complejos Chl~ P2 y Chl~-P3, así como para la asociación de ~ a Chla-P3. La caracterización del PSI ha podido ser realizada sando membranas enreqicidas en tal fotosistema, aisladas de lamelas por na disociación convencional con Trion X-lO0 (BASSI y SIMPSON 1989a). El complejo no disociado migra de na manera anómala en PAGE, pero s electroforesis desnatralizante revela la existencia de tres bandas mayoritarias. Ss características espectrales dan máximos de absorción a 674 nm (florescencia a 690 nm), 677 mii (florescencia a 730 nm) y 680 nm (florescencia a 720). Estos complejos, aislados de cebada, son denominados con las siglas LHCI-680, LHCI-730 y P700-Chla-P1, respectivamente. Cando la cantidad de Triton X- 100 sada para la extracción disminye, n típico complejo LHCII aparece, anqe no hay contaminación con PSII. Este complejo sólo es fncional en PSI si LHCI-680 está presente. En Lemna gibba, sin embargo, n solo complejo LHCI ha sido encontrado tras solbilización de PSI con nonilglcósido. Este complejo lleva n solo polipéptido asociado, de 24 kda de masa moleclar. Una importante cestión es si PSI pede existir en asencia de s fotocentro o viceversa. Se han descrito varios mtantes, tanto de algas como de fanerógamas, a los qe le faltan, bien los complejos clorofila-proteína, bien P700, bien la actividad del PSI. Algnos de estos mtantes deficitarios son mtantes de plastoma lo qe, nido a la inhibición de la síntesis de los complejos por cloranfenicol, indica qe los polipéptidos de estos complejos son codificados por DNA cloroplástico. No obstante, también se han descrito mtantes mendelianos de complejos clorofila-proteína para el PSI, por lo qe en s síntesis parece existir na acción combinada ncleo-plastidio.

52 Introdcción 3 Los complejos LHC (o LHCP) se encentran en todos los grpos de vegetales en los cales la clorofila b es pigmento accesorio (KOHLBRANDT, 1994). Estos complejos nnca contienen centros de reacción (P680 ó P700) y s única fnción es colectar lz. Los polipéptidos de menor tamaño moleclar encontrados en estos complejos son de kda anqe, sbsidiariamente, peden formar oligómeros. Despés de la disociación de la clorofila, la apoproteina sele separarse en dos péptidos principales, de 23 y 25 kda. A veces aparece no secndario, cya masa moleclar es de 28 kda. La razón a/b media para plantas speriores es de 1,3. Una ferte banda negativa en el espectro de dicroismo circlar a 650 nm ha sido interpretada como indicativo de la existencia de n cerpo central de clorofila b dentro de los límites del complejo qe involcra la separación de carga, mientras qe las moléclas de clorofila a forman la parte externa del complejo Topografla fncional de las lamelas tilacoidales La técnica de criofractra aplicada a las lamelas tilacoidales reselve s sperficie en dos caras, na externa, denominada PS, y otra interna, denominada EF. La sperficie qe delimita al lóclo tilacoidal también pede ser reselta en dos caras, na externa, ES, y otra interna PF. El fraccionamiento de estas membranas con digitonina proporciona partíclas PSI y PSII. Cando estas partíclas son sometidas a criofractra, PSI mestra estrctras semejantes morfológicamente en la cara PF de la membrana tilacoidal, mientras qe la morfología de las partíclas PSII mestra ser idéntica a la de las inclsiones encontradas en la cara EF. Las partíclas localizadas en la cara EF oscilan entre los 8 y 20 nm, con máximos aproximados entre nm. Se ha demostrado qe, en cloroplastos enverdeciendo, sólo aparecen las mayores partíclas despés de tiempos prolongados de exposición a la lz, sitación también observada para el cloroplasto de Eteglena. los experimentos realizados con plantas sometidas a la ilminación intermetente demestran qe los cloroplastos se desarrollan con déficit en la clorofila b y complejos LHCP. Tampoco diferencian grana en abndancia y el tamaño máximo qe alcanzan las partíclas de la cara EF (PSII) no sobrepasa los 8,3 nm. Cando estas mismas plantas

53 Introdcción 32 son transferidas a ilminación contina, amenta considerablemente el número de grana y anqe la densidad de partíclas amenta my poco, s tamaño medio se sitúa entre 10,5 y 16,4 mn. Drante este periodo se forman los complejos LHCP y se postla qe estos complejos se nen, en cantidades variables, a n corazón básico para formar las partíclas características de la cara EF. Drante el crso de envejecimiento bajo ilminación intermitente, las partíclas encontradas sobre la cara PF también incrementan ligeramente de tamaño en la membrana tilacoidal. S diámetro amenta de 7,0 a 7,7 nm, lo qe sgiere la adición de algún componente específico. Cando las plantas son transferidas a ilminación contina, las lamelas tilacoidales poseen partíclas cyos diámetros medios son 8,1 y 11,8 nm. Anqe se estima qe las lamelas estromáticas no poseen partíclas identificadas con PSII, na cierta actividad de tal sistema pede ser observada cando tales lamelas se ensayan en condiciones de alta intensidad de ilminación, lo qe implica peqeñas cantidades de PSII, posiblemente asociadas a las partíclas de 11,8 nm. Se posee poca información sobre la estrctra moleclar de las partíclas intergranales en plantas speriores. No obstante, existe n detallado análisis de las membranas de H halobim. Estas membranas contienen n polipéptido sencillo, la bacteriorrodopsina, de 26 kda, qe está embebido en na bicapa qe pede ser criofractrada. Esta técnica revela partíclas intermembranales agrpadas en n enrejado hexagonal, con n espaciamiento de 6,1 nm. Estdios de difracción óptica y reconstrcción de imagen demestran qe cada partícla está compesta por tres moléclas de bacteriorrodopsina, nos 12 polipéptidos por cada partícla de 6,1 mii. MILLER ha sometido algnas partíclas de la cara EF granal de cloroplastos de espinaca a difracción óptica y reconstrcción de imagen. Mediante estas técnicas se ha demostrado la existencia de catro sbnidades por partícla, con indicaciones de otra sbestrctra dentro de cada sbnidad.

54 33 Introdcción Clorofilas de plantas speriores Sin dda, las clorofilas forman el grpo más importante de los pigmentos fotosintéticos, tanto calitativa como cantitativamente. Estrctralmente estos pigmentos son porfirinas, es decir, están constitidas por n anillo tetrapirrólico formado por catro pirroles asociados en posición a. Las moléclas de clorofila presentan en el centro del anillo n átomo de magnesio qelado por los nitrógenos pirrólicos. Los dobles enlaces se presentan, prácticamente, conjgados, de donde s entidad como pigmentos. A través de n enlace éster con n resto propiónico en el anillo IV, se encentra nido n largo brazo hidrofóbico de natraleza terpenoide con veinte átomos de carbono qe recibe el nombre de fitol. La zona visible del espectro es la zona de absorción de todas las clorofilas qe además presentan dos bandas de absorción, la primera llamada banda de Soret, en el azl violeta (máximo entre 430 y 440 nm) y la segnda banda en el rojo y rojo lejano (entre 640 y 720 nm). Las clorofilas son insolbles en aga y solbles en disolventes organicos como alcohol o acetona. La clorofila a esta presenta en todos los organismos qe realizan fotosíntesis oxigénica. Existen también otras clorofilas (b, c, d, a etc.), pero la clorofila b jnto a la a son las más conocidas y las de más amplia distribción, mientras qe las clorofilas c, d y e se encentran en algas jnto a la a. Las formas más florescentes de la clorofila a son las qe absorben a longitd de onda más corta (entre 650 y 680 nm). Estas constityen predominantemente la antena del PSII, mientras qe las qe absorben a longitd de onda más larga (mayor de 680 nm) se encentran en el PSI. Las clorofilas b, c y d forman con los restantes de la clorofila a los pigmentos accesorios, siendo my eficientes captadores de lz. Los pigmentos fotoactivos de los centros de reacción de los fotosistemas 1 y II son moléclas especializadas de clorofila a, conocidas respectivamente como P680 y P700. Cando por hidrólisis, sobre todo alcalina, se separa el fitol, la estrctra resltante recibe el nombre de clorofilida. Sin embargo, lafeofitinización es prodcto de

55 34 Introdcción na rptra de los enlaces qe nen el centro del anillo tetrapirrólico al magnesio, y la liberación de este ltimo en el medio, por acidificación REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL Consideraciones generales y desarrollo histórico Las hormonas vegetales constityen grpos de sstancias qe se encentran natralmente en las plantas. Son compestos orgánicos sintetizados por la planta misma y actúan a baja concentración. Los procesos inflidos consisten principalmente en el crecimiento, diferenciación y desarrollo; sin embargo, otros procesos tal como los movimientos de las céllas de garda peden ser afectados por regladores. El descbrimiento de las sstancias regladoras del crecimiento fe indirectamente señalado en pblicaciones independientes en el siglo XVIII. Al eliminar n anillo de corteza de la parte sperior de n tronco, DUHAMEL de MONCEAU, en 1758, observó qe se prodcía n hinchamiento y se formaban raíces pero nada de esto ocrría en la parte inferior del anillo. Años despés SACHS (1880 a,b), para dar na jstificación a esta observación, propso qe habría na migración basipeta de las sstancias responsables de la formación de raíces desde el lgar de s prodcción, qe es la hoja, hacia los tallos. Habría qe esperar 50 años más para qe la observación de DUHAMEL tviese la interpretación correcta al relacionarla con la existencia de fitohormonas. El concepto de hormonas vegetales o fitohormonas empieza verdaderamente con los experimentos de DARWIN qién pblicó en 1880 na obra bajo títlo El poder de movimientos en plantas donde demostró qe el ápice del coleóptilo de las gramineas era el responsable de qe las plántlas se crvasen hacia la lz. Estos resltados feron apoyados por BOYSEN JENSEN qien, en 1910, realizó experimentos qe llevaron a pensar qe el estímlo era de natraleza qímica. Pocos años despés, PAAL (1918) propso qe había na sstancia estimlante del crecimiento excretada por el ápice qe se difndía de forma simétrica en oscridad y asimétrica cando se ilmina lateralmente

56 Introdcción 35 el coleóptilo, haciendo crecer la zona más oscra. La idea de PAAL fe confirmada por SODING (1931) en experimentos en qe medía el crecimiento lineal de coleóptilos cando tenían o no el ápice. Despés de haber sido confirmada, por varios atores, la existencia de na sstancia regladora del crecimiento vegetal sintetizada en el ápice del coleóptilo, llegó la hora de aislarla y caracterizarla. Fe WENT, en 1928, qién logró aislarla. Siete años despés, CHOLODNY (1935) realizó experimentos clave para obtener grandes cantidades de esta sstancia a partir de semillas embebidas qe habían germinado parcialmente. Las cantidades de esta sstancia regladora del crecimiento vegetal oscilan entre 1 y 100 ~.igpor Kg de peso seco, anqe con las modernas técnicas de extracción y corrección de las pérdidas a lo largo del proceso los valores máximos en algnos tejidos peden ser tres veces mayores Axina Descbrimiento y localización Las axinas feron las primeras hormonas del crecimiento vegetal qe se descbrieron pocos años despés de la caracterización por BERI-IOLD, en 1862, de la primera hormona animal testosterona. El término axina tiene n origen griego, axésis, qe significa elongación cellar. La elongación cellar de tallos o coleóptilos aislados, indcida por axinas, es na de las respestas hormonales más rápidas en plantas. La respesta llega 10 mm despés de la adición de la axina, reslta en 5-10 veces de amento en la razón del crecimiento y persiste horas o inclso días (EVANS, 1985). Utilizando el test de epicótilo de gisante para la localización de la axina en los distintos órganos, se ha notado qe en la plántla de trigo existe alto contenido en el ápice del coleóptilo y va disminyendo a medida qe se desciende a lo largo del mismo, alcanzándose el mínimo en la base y n incremento a medida qe se progresa hacia el ápice de la raíz, siendo el valor en este pnto menor qe el qe existe en el ápice del coleóptilo.

57 Introdcción Relación entre estrctra y actividad Recientemente, y trabajando sobre la estrctra de la axina, KATECKAR y GEISSTER (1982) han llegado a determinar los dominios qímicos responsables de la actividad de la hormona. Estos inclyen n dominio carboxílico y dos correspondientes a los anillos aromáticos. El dominio carboxílico debe de estar formado por n carbono metilénico separado del dominio planar aromático (THIMANN y LEOPOLD, 1955). Sin embargo, COHEN et al. (1985) han demostrado qe n grpo de ácido slfónico pede sstitir al grpo carboxilico. En la actalidad, los estdios están my concentrados sobre la relación estrctra-actividad para lograr la síntesis de nevos regladores de crecimiento con actividad axíníca Biosíntesis en plantas speriores Los estdios de los últimos 50 años concerdan todos en qe la axina se síntetiza a partir del triptófano. Las vías de síntesis del AlA se basan en la evidencia obtenida a partir de la presencia de intermediarios y s actividad biológica y el aislamiento de enzimas capaces de convertir in vivo estos intermediarios en ALA. En algnas especies, la conversión de triptófano predomina drante las primeras etapas del crecimiento normal en maíz, lenteja de aga y Arabidopsis (BIALEK y COHEN, 1992). La formación de axina a partir de triptófano se estdió in vivo e iii vitro en más de 20 plantas mediante preparaciones enzimáticas y estdios de la conversión del triptófano marcado en 14C en axina (SCHNEIDER y WIGHTMAN, 1978; SEMBDENER et al., 1980). Sin embargo, había dificltades en los estdios de la síntesis de AlA a partir de triptófano. Primero, las cantidades del triptófano están mcho más altas qe las de ALA (SCHNEIDER y WIGHTMAN, 1978) y, segndo, simplemente secando el triptófano radiomarcado se prodce ALA con n rendimiento del 30% (EPSTEIN et al., 1980). Para la reglación de la síntesis de AlA, sobre todo, procediendo de n precrsor qe se encentra en altas concentraciones, las plantas peden sar como precrsor de axina el esterioisómero no proteico del triptófano, el D-triptófano, qe no está implica-

58 37 Introdcción COOH NH 2 O/ Triptófano NOH COOH o 0/ 0~ H H lndol-3-acetonitrilo H Ácido indol-3-pírúv co CN 0~ 0~ H Indol-3-acetaldoxima NH2 Triptaniina CH2OH CHO 0/ 0/ H Indol-3-acctaldehido H Indol-3-ctanol COOH 0/ H Ácido indol-3-ac tico Fig. 3. Rtas de síntesis del ácido indol-3-acético a partirdel trintófano propestas en las plantas speriores

59 Introdcción 38 do en la biosíntesis de AlA en brotes de lenteja de aga o de tomate (BALDI et al., 1991; COONEY y NOHEBEL, 1991). Sin embargo, REKOSLAVSKAYA (1986) observó qe en cltivos cellares de tomate y soja, el N-malonil-D-triptófano y el Dtriptófano se convierten en AlA. En cebada se prodce na mayor conversión de Dtriptófano a ALA, qe el L-triptófano a AlA (TSURUSAKI et al., 1990). En fin, existe también na rta de biosíntesis del AlA en la qe no interviene el triptófano, esta rta fe señalada por WRIGHT eta)? (1992) y confirmada también por BANDURSKI et al. (1992), en experimentos donde se tilizó el antranilato marcado con 5N y qe confirmó qe la biosíntesis no está relacionada con el triptófano Los conjgados de la axina Descbrimiento de los conjgados En 1934, THIMANN fe el primero en sgerir qe na parte de axina se encentra bajo forma conjgada. Un año despés, CHOLODNY (1935) demostró por primera vez la existencia de conjgados de axina, al observar qe trozos de endospermo de semillas embebidas en aga colocadas sobre n coleóptilo de avena indcían n crecimiento más grande en la parte donde se ha colocado el endospermo. Despés observó qe se lograba más crecimiento con semillas embebidas en aga qe en alcohol. El mismo ator fe capaz de conclir qe la concentración de axinas conjgadas es mcho mayor en semillas qe en tejidos de avena, maíz y otras gramíneas. Fe, probablemente, el primero en observar la hidrólisis enzimática de conjgados de axina en axina libre. Sin embargo no llegó a ningna conclsión. POHL (1935), LAIBACH y MEYER (1935), HATCHER y GREGORY (1941), HATCHER (1943 y 1945), y AVERY et al. (1940) continaron estos estdios y demostraron qe la hormona de la semilla era probablemente la misma qe la encontrada en la parte sperior del coleóptilo y qe las reservas en la semilla de esa hormona decrementan drante la germinación de la semilla. HEYN (1935) y SKOOG (1937) demostraron qe la separación del endospemio de la semilla tiene más respestas

60 Introdcción 39 qe la axina exógena y impide la regeneración de la dominancia apical. SKOOG (1937) atribyó eso a la existencia de n sitio de almacenaje en la semilla de la del precrsor de la hormona qe será convertida en axina despés de transportarlo al ápice. OVERBEEK (1938) fe qién demostró qe sólo el 5% de axinas se encentra bajo forma disponible y conclyó qe la mayor parte de axinas en plantas se encentra conjgada en forma de precrsores. En todas las plantas estdiadas, la mayor parte de la axina se encentra en forma conjgada, como ésteres en el caso de algnos cereales (COHEN y BANDURSKI, 1982) o como axina nida a amidas en las plantas dicotiledóneas. Los estdios de BANDURSKI y SCHULZE (1974) indican qe al menos el 95% de axina en el tejido joven de brotes de cereales se encentra en forma de éster Hidrólisis de los conjgados de la axina Drante el crecimiento de la plántla y también drante el crecimiento rápido qe se prodce en respesta a n estimlo ambiental, los conjgados de la axina peden hidrolizarse para prodcir axina libre (BANDURSKI y SCHULZE, 1977). Drante la germinación de Zea mays hay na enorme bajada de conjgados de axína en el grano (CORCUERA, 1967; UEDA et al., 1970). UEDA y BANDURSKI (1974) observaron qe ALA-mio-inosotol, ALA-mio-inositol glicósidos y ALA-glcano en maíz, todos desaparecen en razón de casi n 1% por hora drante las primeras 96 horas de germinación. Entonces la pregnta era: Cando los conjgados de ALA desaparecen, son primero hidrolizados para prodcir AlA libre y es el AlA libre despés sado o destrido? La respesta a tal pregnta vino de los estdios de EPSTEJN et al. (1980) qienes demostraron qe el nivel de axinas en el endospermo es constante y se ha conclido qe, en 3 horas, la semilla debía preparar na cantidad de axina igal a la qe inicialmente estaba presente en la semilla. La pregnta ahora es: Cómo la cantidad de axina permanece constante? Entonces debe haber na fente para la neva axína.

61 Introdcción 40 Los estdios de EPSTEIN et al. (1980), UEDA y BANDURSKI (1969), PISKORNIK y BANDURSKI (1972), llevaron a conclir qe la axina prodcida en el momento de la germinación de almendra tiene como fente los conjgados de axina y no el triptófano. HAMILTON et al. (1961) observaron qe la extracción de tejidos de semilla con acetona acosa (n disolvente qe podría desnatralizar las enzimas) prodce poco o nada de AlA libre mientras qe la extracción de tejidos con éter (n disolvente qe podria destrir membranas y atolíticamente libera enzimas) prodce axina. La hidrólisis alcalina también prodce axina (HAMILTON et al., 1961). Los descbrimientos de THIMANN (1934) condjeron al so de cloroformo y éter como disolventes mejores para la extracción de la axína. Los estdios sobre los conjgados de la axina en maíz demostraron qe el principal éster de AlA es el MA mio-inositol, qe se encentra tanto en la semilla como en el brote donde se pede hidrolizarse prodciendo AlA. BANDURSKI et a)? (1990), sando el método de marcaje radioactivo, observaron qe la hidrólisis del AIA-mio-inositol se prodcía con la sficiente rapidez como para cbrir las necesidades del brote en crecimiento. Recientemente, BANDURSKI et al. (1992) encontraron na secencía de reacciones qe podrían proporcionar n mecanismo de hidrólisis de n conjgado qe se origina en la semilla, para formar AlA libre en el brote vegetativo y qe podría ser la sigiente: el AIA-mio-inositol se transporta desde la semilla al ápice de brote, allí se transforma en ALA-glcosa; este último se hidroliza para liberar AlA libre qe es transportado por el floema hacia abajo (GOLDSMITH, 1977) a través del brote (YAHALOM et al., 1991). En fin, BANDURSKI et al. (1992) sgirieron qe podía existir n movimiento reglado de ALA hacia el exterior de la estela o cilindro central para alcanzar las céllas receptoras del parénqima cortical y la epidennis del brote Oxidación de la axina El catabolismo del AlA pede realizarse mediante dos vías: la oxidación descarboxilativa de la cadena lateral y la oxidación no descarboxilativa en las

62 Introdcción 4 posiciones 2 y 3 del anillo indólico. La inactivación del AlA en las plantas pede ser na manera de reglación de s concentración por redcción de ss niveles. A veces, la inactivación del AlA pede lograrse mediante conjgación del AlA con otras moléclas como azúcares, aminoácidos e inclso proteínas y otras macromoléclas Oxidación descarboxilativa La rta de esta oxidación está catalizadapor peroxidasa en nmerosas especies y, a veces, por varios isoenzimas en la misma especie. En 1947, TANG y BONNER encontraron na enzima capaz de catalizar la oxidación de AlA, AlA-oxidasa, qe generalmente tiene las características de peroxidasas y es ahora conocida s distribción en plantas speriores (SCHNEIDER y WIGHTMAN, 1974). Los prodctos mayores de la acción de la AlA-oxidasa son 3hidroximetiloxindol (HINMAN y LANG, 1965) y el ácido indol-3-carboxílico, respectivamente (SEMBDNER et al., 1980). La descarboxilación de ALA pede tener lgar sin añadir cofactores con peroxidasa de rábano; sin embargo, la presencia de Mn2+ y monofenoles tales como el ácidop-cmárico amentan la velocidad de la reacción. Los dos fenoles o- yp-dihidrico (ej. ácido cafeico) y polifenoles actúan casi siempre como inhibidores (SEMBDNER et al., 1980). La presencia de aga oxigenada no siempre es necesaria, anqe acorta el tiempo de oxidación de AlA. La esteqiometria de la reacción es n mol de oxígeno consmido por n mol de AlA destrido. Una alta relación enzima-sstrato con n ph 6 favorece la formación de 3-metilenoxindol, mientras qe indol-3-aldehido es el mayor prodcto a ph 4 y con proporciones esteqiométricas de AlA y peroxidasas. La presencia de Mn2~ y 2-4-diclorofenol también favorece la formación de indol-3metanol, qe, por acción de la propia peroxidasa, pasa a indol-3-aldehido.

63 Introdcción Oxidación no descarboxilativa La oxidación no descarboxilativa ha sido observada en varias plantas. Aún no se conoce bien el papel de las enzimas qe participan en el proceso. Está claro qe los cofactores de la reacción de descarboxilación no intervienen en este tipo de oxidación. EPSTEIN et al? (1980) mostraron qe solamente alrededor de n 10% del recambio de ALA se pede explicar por descarboxilación. Se descbrió qe en el pino existía na actividad enzimática qe prodce indol-3-metanol a partir de AlA marcado radiactivamente a protoplastos. El indol-3-metanol aparece solamente como n catabolito my minoritario (SIJNDBERG et al., 1985). En fin y para ver la importancia de este tipo de oxidación, WALDRUM y DAVIES (1981) observaron qe la degradación peroxidativa del AlA es proporcional al número de secciones en qe se troceaba el tejido y qe la actividad descarboxilativa podía eliminarse lavando la sperficie del tejido.

64 39J 1 O8JUIVOS ti A. Li

65 Objetivos 44 La antiga idea de qe los líqenes epífitos no casan daño a los héspedes está siendo actalmente criticada a la lz de los descbrimientos realizados en los últimos años. Mchos de los líqenes epífitos realizan n aténtico ataqe parasitario sobre ss fitóforos gracias a la inyección de sstancias liqénicas en la savia xilemática. Estas sstancias liqénicas serían transportadas hasta las hojas provocando desfoliación, en mayor o menor extensión, según la densidad de cobertra sobre tronco y ramas. La finalidad principal del presente trabajo se ha orientado a esclarecer el efecto de desfoliación provocado por los líqenes epífitos sobre especies de Qercs, tomando como modelo el caso de la relación entre Evernia prnastri (L.) Ach. y Qercs rotndifolia Lam., observada en El Pardo, Madrid, y también el caso de la relación entre Parmelia hypolecina (J.) Stein. y Qercs sber L., observada en el Canal Zoada, provincia de Larache (Marrecos), donde, en ambos casos, las ramas con na densa población liqénica aparecen total o parcialmente desfoliadas, sin qe aqello peda ser atribido a la edad de la rama. Este efecto es particlarmente dramático en arbstos jóvenes, en los qe la invasión por líqenes coincide con na atrofia del individo. Sin embargo, ramas de los mismos árboles sin esa población liqénica presentan n follaje normal. La desfoliación provocada por los líqenes epífitos se basa en dos spestos principales: a) Las hifas liqénicas penetran hasta los haces condctores de las ramas del fitóforo. b) Los fenoles liqénicos peden difndir a la disolción contenida en los haces vasclares y, en s seno, transportadas hasta las hojas, donde ejercerían s acción fitocida. Sobre la base de estos dos spestos descritos, la relación previamente establecida entre la pérdida de actividad fotosintética y desfoliación no parece posible. Al intentar establecer na relación entre presencia de epífitos y número y velocidad de

66 Objetivos 45 desarrollo de yemas foliares, se ha demostrado qe tanto las ramas primarias como secndarias qe soportan epífitos forman menos yemas y, de éstas, se desarrollan menos hojas y más tardíamente qe aqellas qe no mestran líqenes implantados. Aqellas yemas qe podrían calificarse como retrasadas contienen cantidades discretas de los ácidos evérnico y úsnico, fenoles qe han podido ser aislados y caracterizados a partir de dichas yemas. El objetivo principal del presente estdio ha sido programado en las fases sigientes: 1. Estdio de la existencia de sstancias liqénicas en la savia xilemática de las ramas del fitóforo y s translocación hacía las hojas y las yemas. 2. Estdio del mecanismo de acción de las sstancias liqénicas sobre clorofilas extraídas de hojas del fitóforo. 3. Estdio de la posible conjgación entre sstancias liqénicas y axinas del fitóforo como factor responsable del fenómeno de la desfoliación. 4. Estdio de la posible inactivación de la peroxidasa por sstancias liqénicas y s inflencia sobre los niveles de la axina en el fitóforo.

67 E ri r Un 3. MA [ RIAL Y MÚOOOS y U E AM a 1

68 Materialy Métodos SELECCIÓN DE LOS ORGANISMOS Por ser la especie arbórea más afectada y más dañada presentando estados de desfoliación más avanzados en la zona de El Pardo de Madrid (España), se ha escogido la especie de Qercs rotnd~folia Lam. La especie epifitica qe se ha sado como objeto de estdio por ser la posible responsable de la desfoliación y por ser la especie más abndante qe crece en las encinas ha sido Evernia prnastri (L.) Ach. También se ha estdiado la especie epifitica Parmelia hypolecina (J.) Stein. creciendo sobre la especie de Qercs sber en el Canal Zoada de la región de Larache (Marrecos) qe nos sirvió como testigo del fenómeno de la desfoliación casado por epífitos OBTENCIÓN DE LAS SUSTANCIAS LIQUIENICAS DE EVERNJA PRUNASTRÍ (L.) ACE. Las sstancias liqénicas han sido extraídas de talos de Evernia prnastri (L.) Ach. Estos talos han sido recogidos de troncos y ramas de Qercs rotncftfolia Lam. Se extraían las sstancias liqénicas del talo mediante lavados scesivos con acetona pra (VICENTE, 1975) en el qe están solbles las catro sstancias liqénicas de esta especie: ácido evérnico, ácido úsnico, atranorina y cloroatranorina. Previamente el talo había sido limpiado de polvo y desecado (el aga retenido por el talo pede casar la formación de emlsiones con la parte insolble y así disminye la capacidad de extracción). La acetona era añadida en cantidades de 50 ml por cada g de talo seco, dejando secar éste entre lavado y lavado. La sma de los scesivos lavados acetónicos, conteniendo la mezcla de las sstancias liqénicas se secó en corriente de aire. Las sstancias liqénicas se recperaron como n polvo amanílo qe se almacena en oscridad a 40C para scesivos experimentos.

69 Material y Métodos 48 Las catro sstancias liqénicas de Evernia prnastri, ácido evérnico, ácido úsnico, atranorina y cloroatranorina sados como patrones cromatográficos, se adqirieron de la firma comercial SIGMA Análisis del extracto acetónico Cromatografía en Capa Fina (TLC o CCF) Se realizó en placas de cristal de 20x20 cm, empleando como adsorbente silicagel G-60 o HF y como disolvente, benceno:dioxano:ácido acético glacial (90:25:4) de acerdo con el método de RAMAUT (1963). Se prepararon cada vez las cantidades jstas (150 mí), para qe el disolvente alcance na altra de 1cm en el fondo de la cbeta. La fase móvil se dejaba en reposo al menos drante 2 horas para qe la atmósfera del tanqe se satrase con vapor del disolvente, lo qe homogeneizaba las condiciones de cromatografia. Las aplicaciones, qe contenían la mezcla de sstancias liqénicas diselta en acetona, se hacían en na línea a 1 cm del borde inferior de la 0C y en oscridad, hasta 1cm del borde sperior placa. Las placas se dejaban correr, a 26 de la placa. Despés se sacaba la placa y se dejaba secar al aire hasta qe perdiera el olor. Las placas se examinaban bajo lz ltravioleta a dos diferentes longitdes de onda, 254 y 366 nm, con los ojos protegidos con gafas especiales. A 254 nm, las manchas se observaban como sombras oscras sobre n fondo florescente. Se marcaban todas las manchas mediante n pnto en el centro de cada na de ellas. A 366 nm se podían observar distinta florescencia dependiendo del tipo de sstancias, anotando el color de las mismas en la placa, así como s sitación. Despés del examen fisico de las placas vino el examen qímico, cando las placas se espolvoreaban con na solción de ácido slfúrico al 10% (y/y) en aga y se calentaban en na estfa drante na hora a 1000C, hasta qe el color estviera bien

70 49 Materialy Métodos desarrollado. Alternativamente las placas se pdieron revelar con KOH, FeCl3, etc. (véase tabla 2) con el fin de facilitar la identificación Cromatografia Líqida de Alta Resolción (HPLC) Se realizó en n cromatógrafo líqido-líqido Varian La mestra desecada se disolvió en acetonitrilo. Las medidas se llevaron a cabo bajo las sigientes condiciones de análisis: Fase estacionaria: Colmna de fase reversa MicroPak-MCH-l0, (200 mm de longitd x 4 mm de diámetro interno y 10 hm de diámetro de partícla). Fase móvil: [aga: ácido acético (98:2, v/v)]:[acetonitrilo] (55:45, y/y) en régimen isocrático. Detector UV a 280 nm. Fljo: 0,7 ml.min. 0C. Temperatra: 25 Presión: 80 atm. Unidades de absorbancia de fondo de escala: 0,002. Los resltados del análisis se expresan en tanto por ciento de la mestra. Como patrones se tilizaron las sstancias liqénicas aisladas, adqiridas comercialmente Espectrometría de Masas (MS) Una de las sstancias liqénicas, aislada por TLC, fe analizada por GC-MS sando n cromatógrafo de gases Hewlett-Packard, modelo 5890, eqipado con n detector cadropolar selectivo. El análisis de datos fe realizado con na HP 5997 Chenstation. Se só na colmna capilar de 50 m HP-l programada para sbir de 250 0C a 3500C a razón de 40C miii y na energía de ionización por impacto electrónico de 70 ew (TOROK et al., 1994).

71 Material y Métodos VISUALIZACIÓN DE SUSTANCIAS LIQUÉNICAS DE RVERNL4 PRUNASTRÍ POR MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE SCANNING (MEB) Una lacinia de material vegetal fresco de Evernia prnastri se fractró a mano para dejar al descbierto la sección transversal. Otra lacinia se congeló con nitrógeno liqido para qe, al fractrarse, presentara na sección más nítida. Despés se colocaron sobre lás portas sjetándolas con Loctite y se depositó na línea de grafito para hacerla condctora. Para dar resistencia a la mestra se recbrió con oro y se observó en el microscopio de barrido CARACTERIZACIÓN FITOQUIMICA DE HOJAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLL Test para fenoles y taninos Se cogió n tbo qe tenía 3,0 ml del extracto hidrofólico de hojas de Qercs rotncftfolia. Se añadieron 2 gotas de solción alcohólica de FeCl3. Se agitó bien y se observó la variación de s color o formación de precipitado abndante, oscro. Se comparaba con n test blanco qe tenía 3,0 ml de aga destilada y 2 gotas de la solción alcohólica de FeCl3. * Coloración variable entre azl y rojo indica la presencia de fenoles; si el tbo qeda blanco indica la asencia de fenoles. * Precipitado oscro de tinta azl indica la presencia de taninos hidrolizables y verde, la presencia de taninos condensados Test para antocianinas, antocianidinas y flavonoides Se cogieron 3 tbos qe tenían 2,0 ml de extracto hidrofilico cada no, no se llevó a ph 3, otro a ph 8,5 y el tercero a ph 11. Se observó el cambio de coloración de material según la tabla sigiente:

72 Materialy Métodos 51 Constityentes Antocianinasy antocianidinas Acido (ph 3) Alcalino (ph 8,5) Alcalino (ph 11) Rojo Lila Azúl -Púrpra Amarillo Flavonoles, flavonas y xantonas Roj o-naranj a Flavononas Test para alcaloides Se cogieron 2,0 ml de extracto hidrofilico, se llevaron a ph 2 y lego se filtraron y se llevaron a n ph de 11 añadiendo el NH4OH. Posteriormente se añadió na fase de eter:cloroformo (3:1 y/y) tres veces. Se separó la fase orgánica de la fase acosa. Se añadió Na2SO4 anhidro para eliminar el exceso de aga y despés se añadieron 6,0 ml de HCl 0,lN. Se cogió la fase acosa y se repartió en dos tbos, 2,0 ml en cada no. Se añadieron en cada no 3 gotas de reactivos de precipitación de alcaloides, HAGER y MAYER, respectivamente. Se observó la formación del precipitado característico. (precipitado flocloso indica la presencia de alcaloides). Preparación de reactivos Reactivo de HAGER: 6 g de ácido pícrico en 50 ml de aga destilada caliente. Reactivo de MAYER: 1,35 g clorro mercúrico en 60 ml de aga destilada + 5 g yodro potásico en 20 ml de aga destilada. Se mezclaron los dos y se llevaron a n volmen de 100 ml Test para esteroides, triterpenoides y saponinas Se añadieron 4,0 ml de cloroformo al extracto hidrofilico seco y se filtró. Se notó la formación de dos fracciones, la solble y la insolble. Se añadieron nos granitos de Na2SO4 anhidro en la fracción solble. Lego se añadió 1,0 ml de anhidrido acético, se agitó savemente y se añadieron 2 gotas de H2S04 concentrado, se agitó y se anotó el color.

73 Material y Métodos 52 Coloración azl no permanente segida de verde permanente indicativo de la presencia de esteroides libres. Coloración parda a roja indicativa de la presencia de triterpenoides pentacíclicos libres VARIACIÓN DE FENOLES EN LA SAVIA XTLEMATICA DEL FITÓFORO Todo el material analizado en este trabajo fe recogido en El Pardo, Madrid. Se analizaron yemas, nervadras, hojas, peciolos y ramitas primarias, secndarias y terciarias pertenecientes a ramas libres y cbiertas de líqenes, principalmente ramas qe soportan sobre s corteza densas poblaciones del liqen epifito Evernia prnastri. Para el estdio de la variación anal de las sstancias liqénicas en las ramitas primarias, secndarias y terciarias de Qercs rotndifolia Lam. pertenecientes a ramas control y ramas cbiertas del liqen, se cortaron fragmentos de aproximadamente 0,175 g de peso entre los dos extremos apical y basal de las ramas cortadas. El mismo día de s recolección, las ramas se colocaron en los tbos de centrífga de manera qe s extremo apical qedara hacia abajo y se sometieron a na centrifgación de 5000 x drante 15 mm (modificado de AVALOS et al., 1986) para extraer la savia xilemática. Los residos feron diseltos en acetona para análisis por TLC o en acetonitrilo para análisis por HPLC. Para el estdio de las sstancias liqénicas en las yemas, nervadras, peciolos y hojas de Qercs rotnd~folia Lam. pertenecientes a ramas control y ramas cbiertas del liqen, se recogieron las mestras todos los meses de ensayo, na vez en el laboratorio, se maceraron por separado en acetona para extraer sstancias liqénicas. Los extractos acetónicos se secaron en corriente de aire y los residos secos se disolvieron o en acetona para análisis por TLC o en acetonitrilo para análisis por HPLC (modificado de LEGAZ y VICENTE, 1983).

74 Materialy Métodos Técnicas de cromatografía en capa fina Los análisis por cromatografia en capa fina (TLC) se realizaron en placas de cristal 20 x 20 cm sando como adsorbente el silicagel 60 0 y como disolvente benceno:dioxano:ácido acético galacial (90:25:4). Las condiciones cromatográficas son las mismas qe se han explicado en el apartado Técnicas de cromatografía líqida de alta resolción Los análisis por cromatografia líqida de alta resolción (HPLC) se realizaron en n cromatógrafo Varian 5000 eqipado con n comptador Vista 401. Las condiciones cromatográficas son las mismas qe se han explicado en el apartado salvo qe aqí la composición de la fase móvil era [aga:ácido acético (98:2)]:[acetonitrilo] (20: y/y), con na presión de 66 atm. CONDICIONES DE INCUBACIÓN DE LAS RAMAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLL4 Las ramas tilizadas en este trabajo para esclarecer el mecanismo de progresión acrópeta de las sstancias liqénicas en la savia xilemática, han sido ramas de Qercs rotndifolia Lam. recogidas en la misma zona y seleccionadas con criterios de homogeneidad. Las ramas recién recogidas eran pestas a incbar en NaHCO3 lmm para el control y en medio conteniendo na concentración de 14 yig mr de ácido úsnico diseltas en el mismo bicarbonato sódico, drante 5 días. En dos solciones, se añadieron, el segndo día de incbación, concentraciones de 0,2 mm de MgCl2 y MnCl2 por separado. Se cogieron, todos los días del experimento, yemas, nervadras, peciolos y hojas procedentes de ramas control y ramas tratadas con ácido úsnico y se maceraron con

75 Materialy Métodos 54 acetona para extraer fenoles. Los extractos acetónicos se secaron en comente de aire. Se disolvieron los residos en acetonitrilo y se analizaron por HPLC. Las condiciones cromatográficas son las mismas qe se han explicado en el apartado Para el estdio de la actividad de la reacción de Hill, se arrancaron, todos los días del experimento, hojas frescas. Lego se extrajeron los cloroplastos. Las condiciones de la extracción de cloroplastos son las mismas qe las del apartado Para el estdio de la progresión acrópeta del ácido úsnico en el xilema de Qercs rotndwolia, se valoró, por HPLC, la acmlación de este compesto fenólico en peciolos, nervadras, hojas y yemas drante los 5 días de la incbación MEDIDA DE LA REACCIÓN DE HILL Obtención de cloroplastos Los cloroplastos feron aislados por maceración de hojas de encina en 40 ml de tampón fosfato 75 mm, ph 6,9. La sspensión obtenida fe filtrada a través de 5 capas de gasa y el extracto obtenido se centrifgó a 7000 x g drante 10 mm a 00C, con lo qe se precipitaron los cloroplastos Ensayos de la actividad fotolitica Los cloroplastos obtenidos a partir de 10 g de hojas de ramas control o de las incbadas con distintos tratamientos eran resspendidos en 7 ml de tampón fosfato 75 mm, ph 6,9. La reacción se midió como descenso de la densidad óptica a 600 nm del 2,6 diclorofenol indofenol (DCPIP). Los tbos de reacción contenían, en n volmen de 9,0 mí, 1,0 ml de DCPIP 0,52 mm, 1,0 ml de sspención lamelar y 7,0 ml de tampón fosfato 75 mm, ph 6,9. En el tbo blanco la sspensión de cloroplastos activos se sstitía por tampón fosfato. El tbo control fe conservado en oscridad mientras qe

76 SS Material y Métodos el blanco y el tbo de reacción se colocaron a 15 cm de na lámpara de 100W de intensidad, separados de ésta con n filtro de aga para evitar el calor, midiéndose la reacción cada 10 mm drante 40 mm. Los resltados obtenidos se expresaron en nidades de densidad óptica min1 para la actividad de la reacción de Hill y en mii? de oxígeno liberado mg4 clorofila mm para la intensidad de la reacción de Hill. Las valoraciones de la actividad de la reacción de Hill se llevaban a cabo a lo largo de 5 días, valorándose en nas ocasiones el efecto del ácido úsnico y en otras este mismo efecto en presencia de MgCl 2 y MnCl Medida de las clorofilas Las clorofilas se obtvieron de cloroplastos aislados mediante extracción en acetona al 80% en oscridad y en frío. Despés, se centrifugaron a la velocidad de la sedimentación de los cloroplastos, valorando la densidad óptica del sobrenadante a 649 nm y 665 nm y calclando la concentración de clorofilas mediante la fórmla de STRAIN eta)? (1971) ESTUDIO DE LA DEGRADACIÓN DE CLOROFILAS CAUSADA POR SUSTANCIAS LIQUENICAS Valoración de la degradación de clorofilas por espectrofotometría Las clorofilas a y Li obtenidas mediante la extracción en acetona al 80% (véase apartado ) feron incbadas con HCl 0,lN, NaOH 0,lN y atranorina, ácido úsnico, o ácido evérnico, por separado, a na concentración de 0,23 mg.mv, drante 90 mm. Se medía la concentración de clorofilas a y Li cada 15 mm, valorando s densidad óptica a nm y 665 nm. Los resltados obtenidos se expresaron en ~igde clorofila me

77 56 Materialy Métodos Valoración de la degradación de clorofilas por HPLC Técnicas de cromatografia líqida de alta resolción Los análisis por cromatografia líqida de alta resolción (HPLC) de la permeabilidad de los cloroplastos a las sstancias liqénicas se realizaron en n cromatógrafo Varian 5000 eqipado con n comptador Vista 401. Las condiciones cromatográficas son las mismas qe se han explicado en el apartado mientras qe los análisis de la degradación de clorofilas y cantificación de prodctos se realizaron bajo las condiciones cromatográficas sigientes: a) fase estacionaria: colmna de fase reversa Spherisorb 55 (200 mm x 4,6 mm de diámetro interno y Sgm de diámetro de partícla); fase móvil: gradiente de metanol y acetonitrilo según el esqema adjnto; T0 250C; Ade análisis. De tiempo O a tiempo 12 mm = 430 nm y de tiempo 12,1 mm al final = 410 nm. 1, ,4 + 1,2 c 4, -1, 4> e o -4 o 0,8 60 B -4 o o e- o> o a, 0, ,4 o> o o o. 20 o 0,2 ffih[hlhiiiiiiiii , , Tiempo (mm) A: Metanol; B: Metanol:Acetonitrilo <70:3O,v/v) 46 0

78 57 Materialy Métodos Estdio de la penetración de fenoles en el interior del cloroplasto Los cloroplastos tilizados en este trabajo, qe eran cloroplastos activos para la fotorredcción de DCPIP (ORUS et al., 1981), feron aislados por maceración de 1,5 g de hojas de encina en n volmen sficiente de tampón fosfato 50 mm, ph 6,9. Las condiciones de extracción feron las mismas qe se han explicado el apartado pg de ácido úsnico y 100 pg de atranorina se disolvieron en 1,0 ml de acetonitrilo. Lego feron añadidos, por separado, a na solción de 6,0 ml de NaCí al 0,2 % (p/v). Se conservó la mezcla drante n periodo de 3 días en oscridad y a temperatra ambiente para promover la evaporación del acetonitrilo. Despés se añadió 1,0 ml de la sspensión lamelar de cloroplastos a cada na de las dos mezclas y se conservaron 1 día en oscridad a 40C. Se centrifgó la mezcla a 00C. Se obtvieron 2 fases: el sobrenadante y el precipitado qe contenía la sspensión lamelar. Se añadieron 9,0 ml de eter etílico:acetato de etilo (65:35 y/y) en el tbo qe contenía el sobrenadante y se agitó drante 2 mm. Se recogió la fase orgánica y se repitió este paso na segnda vez. Al final se obtvieron 18,0 ml de fase orgánica qe se secó en corriente de aire y se analizó por HPLC, despés de haber sido diselto el resido en 1,0 ml de acetonitrilo. Se sigió n proceso similar con el precipitado despés de romper la membrana de cloroplastos con ltrasonidos (20 Hz.&1) en 2,0 ml de aga destilada Estdio de la degradación de clorofilas y cantificación de prodctos Los pigmentos fotosintéticos feron aislados por maceración de lg de hojas de Q. rotnc4folia en n volmen sficiente de acetona hasta obtener na pasta homogenea. El extracto se filtró a través na mlticapa de gasa y se secó en corriente de aire. La degradación de clorofilas a y Li se observó despés de s incbación con 100 iag de ácido evérnico, 100 pg de ácido úsnico, 100 ~g de atranorina, HCl 103N y NaOH 1 03N en diferentes disolciones qe contenían 1,0 mg de pigmentos fotosintéticos diseltos previamente en 60 ~il de metanol. La mezcla se conservó en

79 Materialy Métodos 58 oscridad y a temperatra ambiente y despés se analizó por HPLC cada hora drante 5 horas OBSERVACIóN ULTRAESTRUCTURAL DE LAS HOJAS DE RAMAS DE Q. ROTUNDIFOLL4 LIBRES Y CUBIERTAS DE LÍQUENES EPIFITOS Técnicas de microscopia electrónica de transmisión (MET) para el estdio del efecto de las sstancias liqénicas sobre los cloroplastos Cortes ltrafinos Fijación En este estdio se han cogido hojas procedentes de ramas de Qercs rotndwolia Lam. qe estvieron my pobladas de líqenes epífitos, en especial de Everniaprnastri (L.) Ach. Como hojas control, se han tomado aqellas pertenecientes a ramas libres de epífitos. La época de la recogida de mestras ha sido en marzo. Las hojas feron prefijadas con gltaraldehído. Para ello se seccionó la zona central de las hojas madras en trozos de 1 mm poco más o menos. Inmediatamente feron prefijadas con gltaraldehido al 3,25% en tampón Sorensen 0,1M ph 7,3. El gltaraldehido se prepara en el momento de s so a partir de na solción comercial al 25% de la firma FLUKA. Se mantvieron 3 horas en esta solción fijadora de gltaraldehido, a 40C. A continación se lavaron dos o tres veces con el tampón donde permanecieron toda la noche en nevera. Al día sigiente se postfijaron con tetróxido de osmio, OsO 4, al 1% en el tampón, drante 2 horas y a temperatra ambiente. Se debe preparar na solción de ácido ósmico al 2% como mínimo 48 h antes de s empleo a partir de na ampolla de tetróxido de osmio (SERVA) a la cal hay qe qitar perfectamente la etiqeta, pasar por aga caliente y a continación por aga fría para qe se formen peqeños cristales del ácido en las paredes de la ampolla. Se rompe la ampolla en el interior de n frasco conteniendo aga destilada en cantidad necesaria para obtener la concentración citada. En el momento de s so, esta solción, qe está al

80 Maten aly Métodos 59 2%, se dilye en tampón Sorensen 0,lM ph 7,3 a partes igales para consegir na disolción al 1% de tetróxido de osmio qe se emplea en la postfij ación Deshidratación Las mestras doblemente fijadas se deshidrataron mediante solciones de etanol progresivamente más concentradas hasta llegar al 100% donde permanecieron 3 horas: etanol al 30% 15 mm etanol al 50% 15 miii etanol al 70% 15 etanol al 90 % 30 miii etanol al 90% 30 miii etanol al 100% hora etanol al 100% hora etanol al 100% 11-jora mm Inclsión Despés de dos lavados de 20 mm con óxido de propileno, se inclyen las mestras en medio Sprr (SPURR, 1969). Esta resma lleva los sigientes componentes: VCD (resma) log DER 736 (Ilexibilizador) 6g NSA (endrecedor) 26g Dimetilaminol (acelerador) 0,2g Finalmente se mantvieron las mestras en Sprr pro a 40C drante na noche, habiéndose renovado el Sprr na vez. A continación se colocaron en moldes silicona y rellenado de Sprr.

81 Material y Métodos 60 La polimerización de la resma de los moldes, en cyo fondo están inclidas las mestras, se realizó a 700C drante 24 horas Ultramicrotomía Los cortes ltrafinos ( A) de las mestras inclidas en Sprr se obtvieron con n ltramicrotomo REICHERT-JUNG ULTRACUT E, empleándose na cchilla de diamante DUPONT. Los cortes así consegidos qedan flotando sobre na sperficie de aga destilada y s grosor se observa por reflexión de lz. De la sperficie del aga se recogen por contacto con rejillas de cobre de 3 mm de diámetro y 200 mallas Tinción Los cortes ltrafinos se tiñeron con citrato de plomo (REYNOLDS, 1963), drante 8 mm y feron observados en n microscopio electrónico de transmisión PHILIPS Toma de fotografías Los cortes ltrafinos obtenidos de los inclsiones del tratamiento de hojas han sido analizados con el microscopio electrónico. Para el estdio del efecto de las sstancias liqénicas de Evernia prnastri (L.) Ach. sobre la organización de tilacoides, el tamaño y la ltraestrctra de los cloroplastos de hojas de Qercs rotndfolia Lam., se han tomado varias fotografias sobre estos cortes Análisis de Imagen El estdio morfométrico de las hojas de Qercs rotndwolia Lam. procedentes de ramas cbiertas de liqen Evernia prnastri (L.) Ach. y ramas control se ha llevado acabo con n analizador de imagen semiatomático, MOP VIDEOPLAN, de la marca KOHTRON.

82 Material y Métodos CONDICIONES DE TRATAMIENTO DE LAS YEMAS DE Q. ROTUNDIFOLIA CON AUXINA EXÓGENA Las yemas apicales de ramas de Q. rotndffolia Lam. my pobladas de líqenes epifitos, principalmente por Evernia prnastri, feron tratadas con axina exógena al 1 & M desde enero hasta abril del 96, y otras mestras han sido tratadas, en las mismas condiciones, desde abril hasta jlio del 97. Las mestras tratadas han sido recogidas en jlio del 97 y agosto del 97, respectivamente. La axina libre y la conjgada han sido extraídas de estas mestras y analizadas por HPLC. Como yemas control, han sido aqellas pertenecientes a ramas pobladas de liqenes epífitos pero sin tratamiento con axína exógena ANÁLISIS Y VALORACIÓN DE AUXINAS EN YEMAS CON Y SIN TRATAMIENTO CON ATJXINAS EXOGENAS Extracción de axina Yemas apicales y ramitas de 9. rotnd4folia Lam. pobladas por Evernia prnastri (L.) Ach. han sido recogidas en El Pardo de Madrid, y transportadas al laboratorio para s analisis. Como control han sido sadas yemas apicales y ramitas procedentes de ramas de Qercs rotnd~folia Lam sin líqenes epífitos. Se maceraron las yemas apicales y las ramitas por separado en metanol al 70% qe contenía 100 jig.me de hidroxitoleno btilado y se mantvo el homogeneizado agitándose na noche en oscridad a 60C. Despés la mezcla se centrifgó a 5000 x g drante 10 mm a 40C. Se tiró el precipitado y el sobrenadante, qe tenía la axina, se secó en corriente de aire a 500C. La fase acosa se dividió en dos partes, na para analizar axina libre, la otra para axina conjgada. La primera se ajstó a n ph 2,5 con ácido clorhídrico y despés se añadieron 2 volúmenes de éter etílico. Se agitó la mezcla drante 1 mm y se formaron 2 fases: na de ellas, la de éter etílico, contenía la axina. Esta fase orgánica se secó en corriente de aire y se disolvieron los residos en 1,0 ml de éter etílico para análisis por TLC o, alternativamente, en 0,5 ml de acetonitrilo para análisis por HPLC.

83 Maten aly Métodos 62 La segnda parte, qe se só para determinar la axina conjgada, se ajstó a n ph alcalino (ph 8,5) con sosa y se gardó a 1000C drante 3 horas para hidrolizar los conjgados (BANDURSKI y SCHULZE, 1977). Despés de esto, el PH fe redcido a 2,5 con ácido clorhídrico y se sigieron los mismos pasos qe con la axina libre. La cantificación de la axina conjgada se hizo restando la cantidad de la axina libre antes de la hidrólisis de la cantidad de la axina libre despés de la hidrólisis alcalina Técnicas de cromatografía en capa fina (TLC) Para la identificación de la axina por cromatografia en capa fina, las mestras, recperadas de la etapa de extracción de axina, feron depositadas sobre placas de silicagel 60 G, sando cloroformo:acetato de etilo:ácido acético glacial (5:4:1) como disolvente (RAMAUT, 1963). Se detectó la axina por emisión de florescencia despés de examinar las placas bajo lz ltravioleta a na longitd de onda de 366 nm y se identificó sando n patrón de referencia Prificación de la axina Se recperaron del cromatógrama las manchas con el mismo R 1 qe el del patrón de axina, rascando y elyéndolas del polvo con acetonitrilo. Se conservaron na noche 0C. Se en oscridad y el día sigiente se centrifgaron a 5000 x g drante 10 mm a 5 recogieron los residos despés por desecación del sobrenadante Técnicas de espectrofotometría Se disolvieron las mestras anteriormente preparadas en 3,0 ml de metanol cada na. Se hicieron espectros de absorción de las mestras analizadas. Como patrón se só la axina 1 0~ M en metanol y como blanco metanol pro.

84 63 Materialy Métodos Técnicas de cromatografía líqida de alta resolción (HPLC) Para la valoración de la axina por cromatografla líqida de alta resolción, las mestras recperadas de TLC se disolvieron en acetonitrilo y despés se analizaron por HPLC. Las condiciones cromatográficas son las mismas qe se han explicado en el apartado ANÁLISIS DEL CONJUGADO ATJXINA-SUSTM4CIA LIQUÉNICA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN La conjgación in vitro ha sido observada despés de incbar la axina 1 04M con 0,1 mg mf de ácido úsnico en condiciones diferentes de lz, temperatra y ph. El conjgado ha sido detectado por HPLC. Las condiciones cromatográficas son las mismas qe se han explicado en el apartado ANÁLISIS DE LA INCUBACIÓN DE LA AUXINA CON PEROXIDASA CON Y SIN PRESENCIA DE ÁCIDO ÚSNICO POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN La incbación de la axina 2 104M con la peroxidasa, 0,23 mg mr, con o sin el ácido úsnico, 0,5 mg mr, se hizo en 6 tbos de ensayo nmerados de 1 a 6 y poniendo en cada no de ellos 2,0 ml de extracto de ramas de Q. rotndwolia con la concentración de 0,08 mg mv macerados en tampón fosfato 50 mm, ph 6,9. Los tbos de reacción feron repartidos de la manera sigiente: Exfracto,4xina Peroxidasa AcEdo úsnico vegetal 2 )rm 0,23 mg.mt 0,S mg.mt 1 2,Oml 2,Oml 2,Oml 2 2,Oml 2,Oml 2,Oml ml 2,0 ml ,0 ml 2.0 ml - 5 2,Oml 2,Oml ZOmí 2,0 ml ,1 ml --- 0,1 ml --- 0,1 ml HaOi (3%) 2. fosfato Volmen 5OmMpH 6,9 final O,5m1 LSml 8.Oml 0,5 ml L4ml 8,Oml 0,5 ml 3,5 ml 8,0 ml 0,5 ml 3,4 ml 8,0 ml - 4,0 ini 8,Oml - 3,9 ml 8,0 ml

85 64 Material y Métodos El tiempo de reacción fe de n día, tras el cal se paró la reacción por congelación de los tbos. Se secaron las mestras por liofilización. Los residos se disolvieron en 3,0 ml de acetonitrilo y se centrifgaron a x g drante 15 mm a 00C. Se recogió el sobrenadante y se analizó por HPLC. Se añadieron 2,0 ml de acetonitrilo al precipitado, se agitó drante 1 mm y se dejó reposar hasta qe se formaron 2 fases. La fase orgánica de acetonitrilo se recogió y se analizó por HPLC. El pico de degradación de la axina por peroxidasa ha sido detectado por HPLC. Las condiciones cromatográficas son las mismas qe se han explicado en el apartado El ácido úsnico, la axina y la peroxidasa sados en este experimento, se adqirieron de la firma comercial SIGMA OBTENCIÓN DE SUSTANCIAS LIQUÉNICAS DE PARMELL4 HYPOLEUCINA (J.) STEIN Las sstancias liqénicas han sido extraídas de talos de Parmelia hypolecina (J.) Stein. Estos talos han sido recogidos de troncos y ramas de Qercs sber en la zona de Canal Zoada, provincia de Larache (Marrecos), y despés transportados al laboratorio para análisis. Las condiciones de extracción de las sstancias liqénicas de Parmelia hypolecina (J.) Stein son las mismas qe se han explicado en el apartado Análisis del extracto acetónico Técnicas de cromatografía en capa fina Las condiciones de cromatografia en capa fina son las mismas qe se han explicado en el apartado toleno:dioxano:ácido acético (180:60:5 salvo y/y) aqí se tilizó la fase móvil (CULBERSON y KRISTINSSON, 1972; CULBERSON, 1972, 1974; CULBERSON y JOHNSON, 1982).

86 65 Materialy Métodos Técnicas de cromatografía bidiniensional Esta técnica consistió en desarrollar la placa en dos sentidos perpendiclares entre sí con dos disolventes distintos, de tal forma qe en el primer desarrollo las sstancias se repartieron a lo largo de la línea base para el segndo desarrollo (CULBERSON y JOHNSON, 1976, 1981). Esta técnica nos sirvió también para identificar sstancias desconocidas en la mestra por aplicación simltánea de patrones conocidos con la mestra problema. Se tilizaron placas de 20x20 cm. Se trazaron dos líneas base a 2 cm respectivamente de dos lados perpendiclares entre sí, y lego dos líneas frente, paralelas a ss respectivas lineas base, a 10 cm de las mismas. La mestra problema se aplicó en el pnto de crce de las dos líneas base. Las dos fases móviles sadas en esta técnica han sido, benceno:dioxano:ácido acético glacial (90:25:4 y/y) (RAMAUT, 1963) como primer disolvente y dioxano:ácido acético (25:15 y/y) como segndo disolvente. Las placas se examinaban bajo lz ltravioleta a 366 nm y con el desarrollo de colores despés de espolvorearlas con na solción de ácido slfrico al 10% (y/y) en aga y calentarlas 1 hora a 1000C Técnicas de cromatografía líqida de alta resolción Los análisis por cromatografia líqida de alta resolción (HPLC) se realizaron en n cromatógrafo Varian 5000 eqipado con n comptadora Vista 401. Las condiciones cromatográficas son las mismas qe se han explicado en el apartado salvo aqí la presión era de 92 atm.

87 rl rl 4. /WSL/1[AOQS E E II Li

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89 Resallados 4.1. IDENTIFICACIÓN 68 Y CUANTIFICACIÓN DE LAS SUSTANCIAS LIQUÉNICAS DE EVERNL4 PRUNASTRJ(L.) ACH Cromatografía en capa fina (ILC o CCF) Por cromatografia en capa fina se han identificado todas las sstancias liqénicas de Evennia prnastri (L.) Ach. qe desarrollan colores típicos al reaccionar con ácido slfúrico al 10%. Los Rf de tales sstancias dependen de mchas condiciones, tales como la proporción de la fase móvil y el tipo del gel empleado como fase estacionaria (Tabla 2). La Tabla 3 mestra los reactivos y colorantes sados para la detección de las sstancias liqénicas de Everniaprnastri (L.) Ach., en la qe se especifican los colores desarrollados por tales sstancias. Drante la separación por cromatografia en capa fina se ha detectado na sstancia liqénica cyo R1 es de 0,19 y qe absorbe en las mismas longitdes de onda qe las demás sstancias liqénicas. También reacciona con los reactivos qímicos capaces de desarrollar color (Tabla 3). Este descbrimiento nos llevó a prificarla para poder estdiarla con técnicas de gran sensibilidad y eficacia como la espectrometría de masas, qe nos asegró qe no se trataba de n fenol conocido al comparar s masa moleclar con las de las demás sstancias liqénicas descritas para esta especie Cromatografía líqida de alta resolción (HPLC) Por cromatografia líqida de alta resolción se ha podido cantificar la proporción de cada na de las sstancias liqénicas presentes en el talo de Evernia prnastri (L.) Ach. (Fig. 5) y el tiempo de retención de cada na de esas sstancias (Tabla 4).

90 Resltados 69 Silicagel ÓOG Silicagel 60HF ,92 0,96 0,88 0,92 Acido evérnico 0,77 0,76 Sstancia liqán ca X 0,19 0,32 Tabla 2: Valores de R, de las sstancias lipénicas extraídas de Evennia vrnastn (L. > Ach.. por lavado aceténico. y separadas por TLC sando dos tinos de silicaael. Tiempo_de retención_(mm) Acido evérnico 7,98 Acido úsnico 7,49 Atranorina 20,08 Cloroatranorina 24,83 No ident<ficadas Tabla 4: Tiempo de retención de cada na de las sstancias lipánicas de Evernia vrnastri (L.~ Ach. tras s separación por HPLC

91 Resltados 70 Sstancias Liqénicas >. Ácido úsnico Ácido evérnico Atranorina Sstancia Iiqénica X Ácido slfúrico Amarillo Gris Amarillo Azl Clorro férrico Azl-violeta Azl-violeta Azl-violeta Azl-violeta Bencidina Amarillo Azl-violeta Amarillo Amarillo Anilina Clohidrato de anilina p-fenilendiamina Rojo-vino Amarillo Amarillo Amarillo Naranja Azl Reactivos y Amarillo Amarillo ---- Amarillo Naranja N,N-dimetil-p fenilendiamina Amarillo Hidróxido potásico Amarillo Naranja Naranja Hipoclorito cálcico Amarillo Naranja Naranja Amarillo KOH+Ca{OCl)2 Amarillo Naranja Amarillo Clorro cálcico Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Fosfato tricálcico Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Carbonato cálcico Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Slfato cálcico Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Tabla 3: Reactivos sados para la detección de las sstancias lipénicas de Evernia prnastrí (Lfl Ach. por TLC

92 Resliados Microscopia electrónica de barrido Por microscopia electrónica de barrido se han podido observar las sstancias liqénicas de Everniaprnastri (L.) Ach. bajo forma de cristales depositados sobre las hifas del liqen. Las figras 6 y 7 corresponden al material fractrado tras la congelación en nitrógeno líqido, mientras qe las figras 8 y 9 corresponden al material fractrado a mano Espectrometría de masas La sstancia con Rf 0,19 sobre silicagel 60 G fe elida de la placa con acetona, secada y acmlada hasta obtener peso sficiente para s análisis por espectrometría de masas. La señal m/z 662 (Fig. 10) sólo pede interpretarse como correspondiente a la existencia de n dímero del ácido evérnico ( ), según se especifica en la figra 11. Hasta ahora sólo se había descrito la existencia de n dímero del ácido solorínico en Sobrina crocea (STEGLICH y JEDTKE, 1976). La labilidad de los grpos metoxilo al impacto electrónico jstifica la aparición de fragmentos de m/z 647 y 515 (Fig. 12). La rptra del anillo B podría dar lgar a la formación de fragmentos m/z 532 (531, 278 y 219), mientras qe la separación completa del anillo B daría lgar a la formación del fragmento m/z 446, con n carboxilo aniónico en lgar de la fnción carbonilo propesta por HUNECK y YOSHIMURA (1996) como típico de la rptra de depsidos. Sí, en cambio, se forman fragmentos semiqinónicos de m/z 532, 514 y 446 (Fig. 12), de acerdo con los citados atores CARACTERIZACIÓN FITOQUIMICA DE HOJAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLIA LAM. El extracto hidrofilico de las hojas de Qercs rotnefifolia Lam. reaccionó con FeCl3 dando n color azl-negro y n precipitado verde característicos de la presencia de fenoles y taninos, respectivamente.

93 Resltados 72 La presencia de flavonoides en hojas de Qercs rotndifolia Lam. fe confirmada por el cambio de color del extracto hidrofilico cando se llevó a n ph 11. Despés de añadir 2 gotas de NaCí en el mismo tbo y calentarlo, se confirmó el cambio de color, lo qe indica la presencia de flavononas. La presencia de alcaloides en las hojas de Qercs rotndwolia Lam. fe confirmada por el precipitado flocloso observado despés de añadir el reactivo de HAGER al extracto hidrofilico. La presencia de esteroides libres fe confirmada por el color verde-azl desarrollado por la parte solble del extracto hidrofilico despés de reaccionar con el Na2SO4, anhidrido acético y H2504. Los resltados completos de la caracterización fitoqimica de las hojas de Qercs rotndwolia Lam. están representados en la tablas.

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99 8 a- o o aa o. o ~0 1.> <JI <o -a tn o o <a> p _ 0.19 en silicagel 0~ al tn o Frecencia Fig. 10: Espectro de masas de la sstanciade It Resltados J o o 78

100 . Resltados 79 PH COO CH3O 3 3 CH 30 COO COOH CH3 OH Acido 3,3 -dievérnico OHO OH O CH3 CH3O CH3 CH3 HO O OH O Acido 4,4-disolorínico (aislado de Sobrina croceapor Steglich y Jedtke, 1976) Fig. 11: Estrctra qímica propesta para el dímero del ácido evérnico y estrctra qímica del ácido disolorínico

101 Resltados 80 Fig. 12: Estrctras qímicas propestas como interoretación de las sefiales m/z de los diferentes fta2mentos del dímero del ácido evérnico obtenidos por espectrometría de masas

102 81 Resltados OH CH3O COO COQE COO COOH CH3 H z 662 Acid o 3,3-d ievérnico 3 COO CH3O COO CH3 z 647 CH3 COO (-COO e 3 CH2 CH 30 COO CH2 CH3 ml z 532 (531)

103 82 Resltados CH3 COO COOH 3 H CH2 COO CH2 3 z 515 CH3 COO COOH.H3 COO CH3 z 446

104 83 Resltados CH3 OH Q COO OH COOH CH3 z 316 CH3 0 COO COOH CH3 OH z 278 CH3 COO O ~j/ YCH2 H z 219 H3C COO CH2 z 111

105 Resltados VARIACIÓN ANUAL DE SUSTANCIAS LIQUÉNICAS DE EVERNL4 PRUNASTAI (L.) ACH. EN EL XILEMA DE RAMAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLIA LAM. El análisis por cromatografla en capa fina del contenido xilemático de ramas de Qercs rotnd~folia (L.) Ach. con cobertra liqénica, indicó la existencia de la principal sstancia liqénica de Evernia prnastrí (L.) Ach., ácido evémico, qe desarrolló n color gris con ácido slfúrico al 10% despés de calentar las placas de TLC na hora a 1000C. El valor de s Rf fe de 0,71, el mismo qe el del ácido evémico patrón (Fig. 13). El análisis mensal por cromatografia líqida de alta resolción, de enero hasta septiembre, confinnó la existencia de los ácidos evérnico y úsnico, de origen liqénico, en el xilema de las ramas de Qercs rotnd~o1 a Lam. con na densa cobertra del liqen epifito Evernia prnastrí (L.) Ach. La concentración de esas sstancias liqénicas ha sido siempre más alta en ramas primarias qe en secndarias o terciarias (Figs. 14 y 15). El ácido evérnico ha sido detectado en la savia xilemática de ramas de Qercs rotndwolia Lam. todos los meses ensayados (Fig. 14); sin embargo el ácido úsnico fe acmlado a partir de febrero (Fig. 15). En peciolos, el ácido evérnico ha sido la única sstancia liqénica detectada (28,3.tg.g peso seco), pero sólo en marzo. En yemas, el ácido evémico ha sido detectado en aqellas procedentes de ramas secndarias en abril (31,4.±g.g peso seco) y en yemas procedentes de ramas primarias en mayo (14,5.ig.g peso seco), pero el ácido úsnico ha sido detectado sólo en jnio (Tabla 6). Sin embargo, no se ha detectado ningno de los dos ácidos, evérnico y úsnico, en extractos de hojas y nervadra media drante los meses ensayados.

106 Resltados 85 Fenol Taninos Flavonoides +4* Antocianinas y Antocianidinas O Flavonoles, Flavonas y Xantonas. O Chalconas y Aronas O Lecoantocianidinas O Cateqinas Flavononas Alcaloides Esteroides + Triterpenos Saponinas o o o Tabla 5: Comnestos qímicos del extracto hidrofihico de hojas de Oercs rotndifolla Lam

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110 Resltados APLICACIÓN DE SUSTANCIAS LIQUÉNTCAS EXÓGENAS A CORTES DE RAMAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLL4 LAM. El análisis por cromatografla líqida de alta resolción de mestras procedentes de las incbaciones de ramas de Qercs rotnd~folia Lam. 5 días en disolciones de ácido úsnico demostraron la acmlación de esta sstancia liqénica desde el primer día en los peciolos y las yemas, mientras qe este fenol fe detectado en las nervadras el segndo día. Sin embargo, en las hojas no se ha detectado ácido úsnico en ningno de los 5 días de incbación (Tabla 7). El ácido úsnico ha sido preferente acmlado en cantidades relativamente altas en las yemas y nervadras PENETRACIÓN DE SUSTANCIAS LIQUÉNICAS EN LOS CLOROPLASTOS El análisis por cromatografia líqida de alta resolción del sobrenadante y del precipitado obtenidos despés de la incbación de cloroplastos con el ácido úsnico y atranorina confirmó qe era más dificil para los ácidos úsnico y evérnico qe para la atranorina atravesar la membrana cloroplástica (Fig. 16). Despés de n día de incbación de cloroplastos con el correspondiente fenol, la cantidad de atranorina recperada del precipitado ha sido casi de 3,5 veces más alta qe la del ácido úsnico (Fig. 16). En ambos casos, el fenol desaparece del medio de incbación a na velocidad más alta de la qe se ligaba a las estrctras del cloroplasto. El análisis por espectrofotometría de clorofilas procedentes de hojas de Qercs rotndijolia Lam. indicó qe la mezcla de clorofilas tiene dos máximos de absorbancia, el principal en 430 mii y el secndario en 665 nm. El pico de 430 nm desapareció completamente despés de la incbación de clorofilas con HCí o con el ácido evérnico, mientras qe el pico de absorbancia en la zona del rojo no sólo se atenó sino qe también se desplazó a na longitd de onda más larga (cerca de 674 nm). La incbación de clorofilas con NaOH y atranorna desplazó el pico de absorbancia en la zona del azl

111 Resltados 90 Yemas de rama primaria Yemas de rama secndaria Yemas de rama terciaria Peso de yemas (mg) Mido isnico (jxg~ Acido úsn co «g g peso seco) 9 3,20 ia 2 3,6 9,1 3,83 cf2 4,2 11,6 3,83 a2 3,3 Tabla 6: Detección del ácido úsnico en yemas procedentes de ramas primarias secndarias y terciarias de Qercs rotndifolia Lam. en jnio Tabla 7: Concentración del ácido úsnico ( ma peso seco~ despés de incbado 5 días con ramas de Qercs rotndifolia Lam

112 Resltados 91 hacia nos valores de longitdes de onda más bajos de 400 nm. Un desplazamiento similar fe observado en la zona del rojo despés del tratamiento con NaOH (absorbancia máxima en 645 nm), como está demostrado en la figra MEDIDA DE LA REACCIÓN DE HILL EN HOJAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLL4 LAM. La medida de la concentración de clorofilas a y b desde enero hasta abril demostró qe dicha concentración fe siempre más alta en bojas de Qercs rotndifolia sin cobertra liqénica qe con cobertra liqénica (Fig. 18). Además, la actividad de la reacción de Hill, estimada como prodcción de oxígeno, mostró estar inflenciada por los liqenes epífitos (Fig. 19). Los cloroplastos aislados de hojas de Qercs rotndifolia Lam. de ramas incbadas 5 días en 4 solciones, tres de ellas conteniendo 14 pg.mr de ácido úsnico en cada na, mostraron n descenso en la actividad de la reacción de Hill, pero n día despés de añadir 0,2 mm del MgCl 2 en la tercera solción y 0,2 mm del MnCl2 en la carta solción, la actividad de la reacción de Hill se recperó. En el carto día se notó na bajada significativa en la actividad de la reacción de Hill para la segnda solción qe contenía el ácido úsnico sólo, pero la actividad de la reacción de Hill se mantvo casi constante en la tercera y la carta solción (Fig. 20).

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118 Resltados DEGRADACIÓN DE CLOROFILAS Y CUANTIFICACIÓN DE PRODUCTOS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN Los análisis por espectrofotometría de las clorofilas aisladas de hojas de Qercs rotndifolia Lam. incbadas con HCl 0,1N y ácido úsnico (0,23 mg.me ) en distintas disolciones demostraron na bajada progresiva en la concentración de clorofila en la disolción, mientras qe las clorofilas del control, incbadas en condiciones normales y sin tratamiento, mantvieron esta concentración casi constante (Fig. 21). Las clorofilas procedentes de hojas de Qercs rotndifolia Lam. incbadas 90 mm con HCl O,1N, ácido evémico o atranorina ambos a na concentración de 0,23 mg.mf en diferentes disolciones, bajan s concentración en la disolción, mientras qe la concentración del control de clorofilas, incbado sin tratamiento, permaneció casi constante drante todo el experimento (Figs. 22 y 23). El análisis por cromatografia líqida de alta resolción de los pigmentos fotosintéticos incbados con sstancias liqénicas confirmó qe la degradación prodcida por el ácido úsnico era más importante qe la prodcida por el ácido evémico o atranorina (Figs. 24, 25 y 26). La incbación de los pigmentos fotosintéticos con el ácido úsnico prodjo na bajada progresiva en la concentración de la clorofila a, mientras qe la concentración de la feofitina a mostró n amento progresivo y inversamente proporcional a la degradación de la clorofila a (Fig. 24). La incbación de los pigmentos fotosintéticos con el ácido evérnico y atranorina mostraron qe la degradación de la clorofila a era más lenta qe la casada por el ácido úsnico para el primer fenol (Fig. 25) y esa degradación no prodjo feofitina en el caso del segndo fenol (Fig. 26), qizá por estar dirigida hacia la prodcción de clorofilidas. La incbación de los pigmentos fotosintéticos con HCI 1 0 3N demostró qe

119 Resltados 98 gran parte de la degradación de la clorofila a era prodcida en el momento de la adición de HCl, formándose al mismo tiempo feofitina a. Esta degradación sigió hasta la primera hora de la incbación; despés, la feofitina a empezó a degradarse también (Fig. 27). La incbación de los pigmentos fotosintéticos con NaOH 1 0 3N demostró qe la degradación de la clorofila a prodcida en el momento de incbación era más importante qe la provocada por HCl y prosigió hasta la tercera hora de incbación, cando la concentración de la clorofila a alcanzó el valor más bajo. También había degradación de feofitina a y prodcción de clorofilidas a y b, qe feron expresados en nidades relativas de centas de área (Fig. 28). La figra 29 mestra el control de los pigmentos fotosintéticos sin tratamiento. La figra 30 mestra los cromatogramas del control y los de los pigmentos fotosintéticos extraídos de hojas de Qercs rotndífolia e incbados con ácido úsnico a Oh y a Sh, y la tabla 8 mestra los tiempos de retención de estos mismos pigmentos tras s separación por HPLC. En todos los experimentos la concentración de la clorofila y la feofitina b qedó casi constante y a n valor my bajo; qizá esto se deba al rango de absorbancia qe cae en el máximo de absorbancia de la clorofila y la feofitina a ESTUDIO MORFOMETRICO COMPARATIVO DE LAS HOJAS DE QUERCUS ROTUNDIFOLL4 LAM. Se han observado cortes ltrafinos de hojas de Qercs rotnd~folia Lam. por microscopia electrónica de transmisión. Se ha estdiado la estrctra de céllas y cloroplastos de hojas procedentes de ramas con densas poblaciones de liqenes epifitos, especialmente Evernia prnastri (L.) Ach. y de hojas control procedentes de ramas sin cobertra liqénica.

120 Resltados Alteración de la estrctra del cloroplasto por las sstancias liqénicas En los cortes ltrafinos de hojas procedentes de ramas con densa población liqénica, los cloroplastos mestran na apariencia desorganizada y la envelta cloroplástica presenta rotras a lo largo de s contorno observado en el corte ltrafino transversal (Fig. 31), pero nada de esto se observa en el corte ltrafino transversal de hojas control (Fig. 32) Alteración de la organización de tilacoides por las sstancias liqénicas La observación del estroma de los cloroplastos en cortes ltrafinos de hojas, procedentes de ramas con densa cobertra liqénica mestra na desorganización tilacoidal de los apilamientos granales y también a veces es dificil observar tal organización tilacoidal por la apariencia del estroma, my denso en algnas zonas del cloroplasto (Fig. 33). En los cortes ltrafinos de hojas procedentes de ramas control se ve claramente la organización tilacoidal por la presencia de n estroma menos denso (Fig. 34).

121 Resaltados 100 Pigmentosfotosiníéticos Tiempo de retención (mita) Clorofila a 7,07 Clorofda b 4,61 Feofitina a 29,59 Feofitina b 21,65 Tabla 8: Tiempo de retención de los piamentos fotosintéticos de hojas de Qercs rotndifolia Lam. tras s separación por HPLC

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131 Resltados jo A ~ ~3i.52l j48. 7 ~ ~50. 13! B -r e, 1 A 4., Fig. 30: Control <A > y oi2mentos fotosintéticos incbados con ácido úsnico a Ob <B >va5h(c >

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